The Putative Mevalonate Diphosphate Decarboxylase from Picrophilus torridus Is in Reality a Mevalonate-3-Kinase with High Potential for Bioproduction of Isobutene
- 作者
- Luca Rossoni, Stephen J. Hall, Graham Eastham, Peter Licence, Gill Stephens
- 单位
- Department of Chemical and Environmental Engineering, Biorenewables and Bioprocessing Research Group, University of Nottingham, Nottingham, United Kingdom; Lucite International, Wilton Centre, Wilton, United Kingdom; School of Chemistry, University of Nottingham, Nottingham, United Kingdom
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2015）
- DOI
- 10.1128/AEM.04033-14
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
重新鉴定来自Picrophilus torridus的推定甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（MVD）的真实功能，并评估其在异丁烯生物生产中的应用潜力。
研究策略
通过序列分析、底物特异性测试、产物鉴定（ESI-MS和NMR）确定酶的真实分类，并比较该酶与酿酒酵母MVD在整细胞、粗提物和纯酶水平上的异丁烯生成速率。
核心内容
来自嗜热古菌Picrophilus torridus的推定甲羟戊酸二磷酸脱羧酶基因PTO1356经克隆表达与纯化后，通过底物特异性测试和产物ESI-MS及NMR鉴定，证实其真实功能为甲羟戊酸-3-激酶（PtM3K），而非脱羧酶。该酶催化甲羟戊酸（MVA）磷酸化生成MVA-3P，对MVA的Km为131±18 μM，kcat为1.9 s⁻¹，活性为3 U/mg；对3-羟基异戊酸的催化效率约低1000倍。在异丁烯生成方面，全细胞表达PtM3K的速率为507±137 pmol min⁻¹ g cells⁻¹，纯酶在50°C下达2880 pmol min⁻¹ mg protein⁻¹，较30°C提高110倍，且比酿酒酵母MVD纯酶高11倍。PtM3K不能磷酸化3-羟基丙酸，可磷酸化3-羟基丁酸但不产生丙烯。该工作首次明确PtM3K属于新发现的古菌MVA途径，其通过生成不稳定中间体3-磷酸异戊酸实现异丁烯生成，且效率显著优于酵母MVD，是异丁烯生物生产的重要候选酶。
创新点
首次纯化并表征了P. torridus推定MVD，证明其实际为甲羟戊酸-3-激酶（M3K）而非脱羧酶；揭示了其通过生成不稳定中间体3-磷酸异戊酸实现异丁烯生成的新机制；异丁烯生成速率显著高于以往报道。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 甲羟戊酸（MVA）途径 | PTO1356 (ptm3k) | PtM3K（甲羟戊酸-3-激酶） | 催化 | 来自Picrophilus torridus，实际为M3K，催化MVA磷酸化生成MVA-3P，并可催化3-HIV生成不稳定中间体3-磷酸异戊酸，进而自发脱羧生成异丁烯。 |
| Escherichia coli BL21(DE3)pLysS | 甲羟戊酸（MVA）途径 | ScMVD (ERG19) | 酿酒酵母甲羟戊酸二磷酸脱羧酶（ScMVD） | 催化 | 作为对照酶，催化MVAPP脱羧生成IPP，也可催化3-HIV生成异丁烯，但效率远低于PtM3K。 |
关键发现
- PtM3K催化甲羟戊酸（MVA）磷酸化生成MVA-3P，对MVA的Km为131±18 μM，kcat为1.9 s-1，活性为3 U/mg
- 对3-羟基异戊酸（3-HIV）的Km为2,348±574 μM，kcat为0.1 s-1，催化效率比MVA低约1000倍
- 全细胞表达PtM3K的异丁烯生成速率为507±137 pmol min-1 g cells-1，纯酶在50°C下达到2,880 pmol min-1 mg protein-1，比30°C时高110倍，比ScMVD纯酶高11倍
- PtM3K不能催化3-羟基丙酸磷酸化，能磷酸化3-羟基丁酸但不产生丙烯。
研究结论
P. torridus的推定MVD实际上是一种甲羟戊酸-3-激酶（PtM3K），属于新发现的古菌MVA途径；PtM3K比酿酒酵母MVD具有更高的异丁烯生成效率，是异丁烯生物生产的重要候选酶。