Cloning, Baeyer-Villiger Biooxidations, and Structures of the Camphor Pathway 2-Oxo-Δ3-4,5,5-Trimethylcyclopentanylcyclo-1-Coenzyme A Monooxygenase of Pseudomonas putida ATCC 17453
- 作者
- Hannes Leisch, Rong Shi, Stephan Grosse, Krista Morley, Helene Bergeron, Miroslaw Cygler, Hiroaki Iwaki, Yoshie Hasegawa, Peter C. K. Lau
- 单位
- Biotechnology Research Institute, National Research Council Canada, Montreal, Quebec, Canada; Department of Biochemistry, McGill University, Montreal, Quebec, Canada; Department of Life Science and Biotechnology and ORDIST, Kansai University, Suita, Osaka, Japan; Departments of Chemistry and Microbiology & Immunology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada, and FRQNT Centre in Green Chemistry and Catalysis, Montreal, Quebec, Canada
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology
- DOI
- 10.1128/AEM.07694-11
- 所属领域
- 生物催化
- 关键词
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解决的核心问题
克隆并表征樟脑代谢途径中的2-氧代-Δ3-4,5,5-三甲基环戊烯基乙酰辅酶A单加氧酶(OTEMO)，解析其三维结构，阐明其底物特异性和对映选择性，并扩展I型Baeyer-Villiger单加氧酶的催化谱系。
研究策略
通过PCR与基因组文库克隆OTEMO基因，在E. coli中异源表达并纯化；利用X射线晶体学解析OTEMO与FAD及FAD/NADP+的复合物结构；通过动力学测定和全细胞生物转化评估底物谱与对映选择性。
核心内容
从恶臭假单胞菌ATCC 17453中克隆了樟脑代谢途径的2-氧代-Δ3-4,5,5-三甲基环戊烯基乙酰辅酶A单加氧酶（OTEMO）基因，在大肠杆菌中异源表达并纯化得到分子量118,000的同源二聚体蛋白。通过X射线晶体学分别解析了FAD结合形式（1.95 Å）和FAD/NADP+结合形式（2.0 Å）的结构，这是首次获得同源二聚体I型Baeyer-Villiger单加氧酶与辅因子结合的复合物结构。结构分析揭示了多个环区域的构象可塑性，为理解BVMO催化循环提供了新的分子基础。酶动力学表明OTEMO对2-正己基环戊酮的催化效率最高（kcat/Km=4.3×10^5 M^-1 s^-1，Km=32 μM），对辅酶A活化底物的亲和力最高（Km=18 μM，kcat=4.8 s^-1）。全细胞生物转化中，4-乙基环己酮氧化得到99% ee (R)的内酯，norcamphor氧化正常/异常内酯比例为50:1，trans-1-decalone拆分E值为120。OTEMO对4-取代环己酮表现出与CHMO对映互补的特性，对双环底物具有高区域选择性，在不对称合成和绿色化学中具有应用潜力。
创新点
首次解析同源二聚体I型BVMO与FAD/NADP+结合的结构；发现多个环区域构象可塑性，揭示BVMO催化循环的新构象状态；OTEMO对4-取代环己酮表现出与CHMO对映互补的特性，且对双环底物具有独特的区域选择性。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pseudomonas putida ATCC 17453 | 樟脑代谢途径 | otemo | OTEMO | 催化 | 樟脑途径中的2-氧代-Δ3-4,5,5-三甲基环戊烯基乙酰辅酶A单加氧酶，催化Baeyer-Villiger内酯化反应 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异源表达 | otemo | OTEMO | 催化 | 使用pSD80载体异源表达，用于蛋白纯化、结构测定和全细胞生物转化 |
| Escherichia coli (重组菌表达CHMOred) | 环己酮降解途径 | chmo | CHMOred | 催化 | 来自Rhodococcus sp. HI-31的参考BVMO，用于底物特异性和对映选择性对比 |
关键发现
克隆并表达了来源于Pseudomonas putida ATCC 17453的OTEMO，纯化得到同源二聚体蛋白（分子量118,000），解析了FAD结合形式（1.95 Å）和FAD/NADP+结合形式（2.0 Å）的晶体结构。OTEMO对2-正己基环戊酮催化效率最高（kcat/Km=4.3×10^5 M^-1 s^-1，Km=32 μM），对CoA活化底物亲和力最高（Km=18 μM，kcat=4.8 s^-1），而游离酸速率仅为0.13 s^-1。全细胞生物转化中，4-乙基环己酮氧化得到99% ee (R)的内酯，norcamphor氧化正常/异常内酯比例达50:1，trans-1-decalone拆分E值为120。酶的Tm为51°C，40°C时半衰期为3.8 min，45°C时小于0.4 min。
研究结论
OTEMO是首个同源二聚体I型BVMO，其结构中的构象可塑性为理解BVMO催化循环提供了新的分子基础。OTEMO对4-取代环己酮的氧化表现出与CHMO对映互补的特性，且对双环底物具有高区域选择性，在绿色化学和不对称合成中具有应用潜力。