Increased Production of Zexanthin and Other Pigments by Application of Genetic Engineering Techniques to Synechocystis sp. Strain PCC 6803
- 作者
- DELPHINE LAGARDE, LAURENT BEUF, WIM VERMAAS
- 单位
- Thallia Pharmaceuticals S.A., L'Ore de l'Ecully, 69132 Ecully cedex, France; Department of Plant Biology and Center for the Study of Early Events in Photosynthesis, Arizona State University, Tempe, Arizona 85287-1601
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2000）
- DOI
- 10.1128/AEM.66.1.64-72.2000
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过遗传工程手段提高集胞藻PCC 6803中玉米黄质等类胡萝卜素的产量，并实现无抗生素标记的基因替换。
研究策略
以psbAII基因座作为整合平台，利用强psbAII启动子过表达类胡萝卜素合成相关基因（crtR、crtP/crtB、酵母ipi），同时通过敲除crtO基因阻断β-胡萝卜素向echinone的分流，组合过表达与基因缺失以重塑类胡萝卜素代谢流。
核心内容
该研究以集胞藻PCC 6803为底盘，利用psbAII基因座作为整合平台，在强psbAII启动子驱动下过表达内源或外源类胡萝卜素合成基因，并结合基因敲除重塑代谢流，旨在提高玉米黄质等类胡萝卜素产量。研究构建了基于sacB负筛选的无抗生素标记基因替换系统，分别过表达crtR、crtP/crtB及酵母ipi基因，并单独或组合敲除crtO。结果显示，过表达crtR使玉米黄质含量较野生型提高约2.5倍，从0.39 μg/ml/OD730升至0.98 μg/ml/OD730，同时β-胡萝卜素和echinone含量降低约2倍，玉米黄质占总类胡萝卜素一半以上。过表达crtP/crtB使myxoxanthophyll和玉米黄质分别增加约50%—60%；敲除crtO后myxoxanthophyll积累超过野生型2倍，且在crtPB2背景下进一步增至1.19 μg/ml/OD730；酵母ipi过表达无明显影响。该研究证明组合过表达与基因缺失可显著改变蓝藻类胡萝卜素组成，其无抗生素标记整合平台为蓝藻代谢工程改造提供了有效工具。
创新点
开发了基于sacB负筛选的无抗生素抗性标记基因替换系统；证明了psbAII启动子可高效驱动内源及外源基因在Synechocystis中过量表达；通过组合策略显著改变类胡萝卜素组成，使玉米黄质成为主要类胡萝卜素。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtR | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 过表达后使玉米黄质含量提高2.5倍，玉米黄质成为主要类胡萝卜素 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtP | 八氢番茄红素脱饱和酶 | 催化 | 与crtB共同过表达，增加myxoxanthophyll和玉米黄质含量 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtB | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 过表达crtP和crtB使总类胡萝卜素含量增加，推测八氢番茄红素合酶为限速步骤 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类胡萝卜素生物合成 | crtO | β-胡萝卜素酮化酶 | 催化 | 敲除后echinone消失，myxoxanthophyll积累增加 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 类异戊二烯生物合成 | ipi (来自酿酒酵母) | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 外源表达该基因未改变类胡萝卜素含量，可能IPP异构化非限速步骤 |
| Synechocystis sp. PCC 6803 | 光合作用 | psbAII | D1蛋白 | 调控 | 其强启动子被用作过表达整合平台，编码区被替换为目标基因 |
关键发现
- 过表达crtR使玉米黄质含量比野生型提高2.5倍（0.39→0.98 μg/ml/OD730），β-胡萝卜素和echinone含量降低约2倍；过表达crtP和crtB使myxoxanthophyll和玉米黄质含量增加约50%-60%（myxoxanthophyll
- 45→0.75，zeaxanthin
- 39→0.55）；过表达酵母ipi对类胡萝卜素含量无显著影响；敲除crtO后myxoxanthophyll积累量超过野生型的2倍（0.45→1.05），且在crtPB2背景中进一步增加至1.19。crtR2菌株中玉米黄质占总类胡萝卜素的一半以上。
研究结论
通过过表达和删除特定基因的组合策略，可以显著改变集胞藻PCC 6803的类胡萝卜素含量与组成，实现玉米黄质等目标产物的过量积累；该无抗生素标记的整合平台适用于蓝藻代谢工程改造。