Physiological Role of β-Phosphoglucomutase in Lactococcus lactis
- 作者
- Fredrik Levander, Ulrika Andersson, Peter Rådström
- 单位
- Applied Microbiology, Center for Chemistry and Chemical Engineering, Lund Institute of Technology, Lund University, SE-221 00 Lund, Sweden
- 杂志
- Applied and Environmental Microbiology（2001）
- DOI
- 10.1128/AEM.67.10.4546-4553.2001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明β-磷酸葡萄糖变位酶（β-PGM）在乳酸乳球菌碳水化合物分解代谢和合成代谢中的生理作用，特别是其在麦芽糖和海藻糖利用途径中的功能。
研究策略
通过双交换重组构建稳定的pgmB基因缺失突变株TMB 5002，在受控pH发酵条件下比较野生型与突变株在葡萄糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖上的生长、产物形成、细胞形态和组成，并结合酶活测定、胞内外代谢物分析和多糖表征来解析代谢途径。
核心内容
该研究通过双交换同源重组构建了乳酸乳球菌pgmB基因敲除突变株TMB 5002，在受控pH发酵条件下系统比较了野生型与突变株在葡萄糖、乳糖、麦芽糖和海藻糖上的生长与代谢差异。结果显示，以葡萄糖或乳糖为碳源时，突变株生长速率与野生型相近，而在麦芽糖上最大比生长速率从0.54 h⁻¹骤降至0.05 h⁻¹，且在海藻糖上完全无法生长。突变株在麦芽糖上乳酸产量降低至0.354 Cmol/Cmol，转而积累甲酸、乙酸、乙醇，并在培养基中分泌约5 mM的β-葡萄糖1-磷酸。突变株细胞体积显著增大，胞内碳水化合物/蛋白比升至1.46 g/g，胞外多糖产量达30 mg/L，约为野生型的6倍。胞内β-葡萄糖1-磷酸和海藻糖6-磷酸浓度分别高达约0.7 M和2.7 M。该研究确证β-磷酸葡萄糖变位酶是麦芽糖和海藻糖分解代谢的关键酶，并首次揭示乳酸乳球菌通过海藻糖6-磷酸磷酸化的新途径降解海藻糖，该途径区别于麦芽糖代谢，为乳酸菌糖代谢网络的理解提供了重要补充。
创新点
1. 利用最小整合载体和双交换同源重组构建了稳定的β-PGM敲除突变株，避免了单交换插入突变的不稳定性。2. 首次发现乳酸乳球菌中海藻糖通过一种新型途径降解：海藻糖6-磷酸被磷酸化生成β-葡萄糖1-磷酸和葡萄糖6-磷酸。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435（野生型）及突变株TMB 5002 | 麦芽糖/海藻糖分解代谢 | pgmB | β-磷酸葡萄糖变位酶（β-PGM） | 催化 | 催化β-葡萄糖1-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸；pgmB缺失导致麦芽糖生长速率降低10倍以上，海藻糖完全不能生长。 |
| Lactococcus lactis subsp. lactis ATCC 19435 | 麦芽糖分解代谢 | malP | 麦芽糖磷酸化酶 | 催化 | 以磷酸依赖方式裂解麦芽糖为葡萄糖和β-G1P，为β-PGM提供底物。 |
关键发现
- 在葡萄糖或乳糖上，野生型和pgmB突变株的最大比生长速率分别约0.8 h⁻¹和0.7 h⁻¹，无显著差异
- 以麦芽糖为碳源时，野生型μmax为0.54 h⁻¹，而突变株仅0.05 h⁻¹
- 突变株在海藻糖上完全不能生长。突变株在麦芽糖上乳酸产量降低（0.354 Cmol/Cmol），而甲酸、乙酸、乙醇产量增加（分别为0.115、0.111、0.116 Cmol/Cmol），并有约9%的麦芽糖以β-G1P形式积累在培养基中（终浓度5 mM）。突变株细胞显著变大，积累α-1,4-葡萄糖多糖，碳水化合物/蛋白比达1.46 g/g（野生型为0.38 g/g）
- 胞外多糖产量为30 mg/L（野生型为5 mg/L）。在麦芽糖或海藻糖培养的突变株细胞内，β-G1P和T6P浓度分别约为0.7 M和2.7 M。
研究结论
β-磷酸葡萄糖变位酶是乳酸乳球菌麦芽糖和海藻糖分解代谢中的关键酶，其缺失导致麦芽糖利用严重受损和海藻糖无法利用；海藻糖在乳酸乳球菌中通过一种涉及T6P磷酸化的新途径降解，该途径与麦芽糖代谢不同。