Carotenoid β-Ring Hydroxylase and Ketolase from Marine Bacteria—Promiscuous Enzymes for Synthesizing Functional Xanthophylls
- 作者
- Norihiko Misawa
- 单位
- Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University
- 杂志
- Marine Drugs（2011）
- DOI
- 10.3390/md9050757
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
海洋细菌来源的类胡萝卜素β-环羟化酶（CrtZ、CrtG）和酮化酶（CrtW）的底物混杂性，以及如何利用这些酶基因在大肠杆菌中高效合成功能性叶黄素，尤其是商业上重要的虾青素和自然界稀有的2(2')-羟基化类胡萝卜素。
研究策略
系统综述CrtW、CrtZ、CrtG的催化特性与底物谱，并汇总利用来自Paracoccus sp. N81106、Brevundimonas sp. SD212等海洋细菌的酶基因与Pantoea crt基因组合，在大肠杆菌中进行途径工程合成不同叶黄素的研究。
核心内容
该研究系统分析了海洋细菌来源的类胡萝卜素β-环羟化酶（CrtZ、CrtG）和酮化酶（CrtW）的底物混杂性，并利用这些酶基因在大肠杆菌中开展组合生物合成，以高效生产功能性叶黄素。研究将来自Paracoccus sp. N81106、Brevundimonas sp. SD212等海洋细菌的crtW、crtZ、crtG基因与Pantoea的crtE、crtB、crtI、crtY基因共表达，构建了多条类胡萝卜素合成途径。结果显示，Brevundimonas sp. SD212的CrtW催化效率最高，将其与Pantoea ananatis的CrtZ共表达后，重组大肠杆菌以虾青素为主要产物；CrtG则能接受未取代的β-环，催化2(2')-羟化，生成2,2'-二羟基角黄素、nostoxanthin等自然界稀有的叶黄素。在烟草叶绿体中表达密码子优化的crtW和crtZ后，虾青素积累量达5.44 mg/g干重，占总类胡萝卜素的74%。此外，通过甲羟戊酸途径工程改造的大肠杆菌在72 h内番茄红素产量达22 mg/g干重。这些结果说明海洋细菌来源的混杂修饰酶在大肠杆菌中组合表达，既能高效合成虾青素等商业叶黄素，也能获得化学合成困难的稀有2(2')-羟基类胡萝卜素，后者对大鼠脑匀浆脂质过氧化表现出强抑制活性，提示其可能具有抗氧化及健康促进作用。
创新点
揭示了海洋细菌CrtW、CrtZ、CrtG具有混杂底物特异性，可接受未取代或取代的β-环；首次阐明CrtG催化β-环2(2')-羟化；通过组合生物合成获得了虾青素、2,2'-二羟基角黄素、nostoxanthin等新/稀有叶黄素；并利用随机突变提高CrtW活性。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtE, crtB, crtI, crtY | CrtE (GGPP合酶), CrtB (八氢番茄红素合酶), CrtI (八氢番茄红素脱饱和酶), CrtY (番茄红素β-环化酶) | 催化 | 来自Pantoea ananatis，用于合成β-胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtW | CrtW (β-环4(4')-酮化酶) | 催化 | 来自Paracoccus sp. N81106或Brevundimonas sp. SD212，催化β-胡萝卜素向角黄素/虾青素转化 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtZ | CrtZ (β-环3(3')-羟化酶) | 催化 | 来自Pantoea ananatis或Paracoccus sp.等，催化β-环3位羟化 |
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtG | CrtG (β-环2(2')-羟化酶) | 催化 | 来自Brevundimonas sp. SD212或B. aurantiaca ATCC 15266，催化β-环2位羟化 |
| Nicotiana tabacum (叶绿体) | 类胡萝卜素生物合成途径 | crtW, crtZ | CrtW, CrtZ | 催化 | 来自Brevundimonas sp. SD212，密码子优化后叶绿体表达，虾青素积累达5.44 mg/g干重 |
关键发现
- 重组大肠杆菌表达4个Pantoea crt基因可产β-胡萝卜素约0.2–1 mg/g干重
- 共表达Brevundimonas sp. SD212 crtW与Pantoea ananatis crtZ后，β-胡萝卜素合成大肠杆菌以虾青素为主
- Brevundimonas sp. SD212 CrtW与B. aurantiaca CrtW氨基酸一致性最高（96.3%），其转化β-胡萝卜素为虾青素效率最高
- CrtG在B. aurantiaca中与SD212 CrtG一致性98.8%，且能接受未取代β-环
- 烟草叶绿体表达SD212 crtW和crtZ（密码子优化）后虾青素积累达5.44 mg/g干重（占总类胡萝卜素74%）
- 通过甲羟戊酸途径工程的大肠杆菌72 h产番茄红素22 mg/g干重
- 另一途径工程菌24 h培养接近20 mg/g干重
- 2,2'-二羟基角黄素对大鼠脑匀浆脂质过氧化有强抑制作用。
研究结论
海洋α-变形菌纲细菌的CrtW、CrtZ和CrtG是混杂的β-环修饰酶，通过在大肠杆菌中组合表达这些酶基因，既能高效生产虾青素等商业叶黄素，也能获得化学合成困难的稀有2(2')-羟基类胡萝卜素，这些稀有叶黄素可能具有抗氧化和促进健康的作用。