A UDP-HexNAc:Polyprenol-P GalNAc-1-P Transferase (WecP) Representing a New Subgroup of the Enzyme Family
- 作者
- Susana Merino, Natalia Jimenez, Raquel Molero, Lamiaa Bouamama, Miguel Regué, Juan M. Tomás
- 单位
- Departamento de Microbiología, Facultad de Biología, Universidad de Barcelona, Diagonal 645, 08071 Barcelona, Spain; Departamento de Microbiología y Parasitología Sanitarias, Facultad de Farmacia, Universidad de Barcelona, Av. Joan XXIII s/n, 08028 Barcelona, Spain
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2011）
- DOI
- 10.1128/JB.01441-10
- 所属领域
- 微生物学
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解决的核心问题
鉴定并表征一种新的UDP-HexNAc:polyprenol-P GalNAc-1-P转移酶（WecP），该酶特异性转移GalNAc至Und-P，区别于已知的WecA酶（转移GlcNAc）。
研究策略
通过体内互补实验（在A. hydrophila、E. coli、S. enterica和K. pneumoniae突变株中表达异源基因）、体外放射性标记酶活测定、膜拓扑结构预测和系统发育分析，表征WecP的底物特异性和功能。
核心内容
该研究鉴定并表征了一种来自嗜水气单胞菌AH-3的新型UDP-HexNAc:polyprenol-P GalNAc-1-P转移酶WecP，区别于已知的WecA酶特异性转移GlcNAc，WecP特异性催化GalNAc-1-P向Und-P的转移。通过体内互补实验证明，WecP可完全恢复AH-3ΔwecP突变体的O34抗原合成；在E. coli wecA突变体MV501和K. pneumoniae 52145ΔwecA中，共表达WecP与Gne（UDP-GalNAc 4-表异构酶）后分别恢复O7和O1抗原合成，LPS糖分析确认GalNAc掺入且无GlcNAc。体外酶活测定显示，纯化的His6-WecP在10 ng时GalNAc掺入活性达224±17 U/mg/min，而GlcNAc掺入始终低于1 U/mg/min，证实其严格的底物特异性。序列分析表明WecP与WecA氨基酸同一性低于30%，但膜拓扑结构与WbaP相似，构成该酶家族的一个新亚组。该发现揭示了Wzy依赖O抗原合成途径中特异性起始GalNAc转移的新机制。
创新点
首次报道具有GalNAc特异性的UDP-HexNAc:polyprenol-P GalNAc-1-P转移酶；WecP的膜拓扑结构与WbaP相似而非WecA，构成该酶家族的一个新亚组。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Aeromonas hydrophila AH-3 | O34-抗原脂多糖生物合成（Wzy依赖途径） | wecP | WecP | 催化 | UDP-GalNAc:polyprenol-P GalNAc-1-P转移酶，催化GalNAc-1-P转移到Und-P |
| Escherichia coli VW187 | O7-抗原脂多糖生物合成（Wzy依赖途径） | wecA | WecA | 催化 | UDP-GlcNAc:polyprenol-P GlcNAc-1-P转移酶，底物为UDP-GlcNAc |
| Salmonella enterica LT2 | O抗原脂多糖生物合成 | wbaP | WbaP | 催化 | UDP-Gal:polyprenol-P Gal-1-P转移酶 |
| Klebsiella pneumoniae 52145 | O1-抗原脂多糖生物合成（ABC转运蛋白依赖途径） | wecA | WecA | 催化 | UDP-GlcNAc:polyprenol-P GlcNAc-1-P转移酶 |
| Aeromonas hydrophila AH-3 | UDP-GalNAc生物合成 | gne | Gne | 催化 | UDP-GalNAc 4-表异构酶，将UDP-GlcNAc转化为UDP-GalNAc |
关键发现
- A. hydrophila AH-3 WecP是首个被证明催化UDP-GalNAc的GalNAc-1-P转移到Und-P的酶，不能利用UDP-GlcNAc。体外酶活测定显示，野生型膜部分对GalNAc的掺入比活为8±1 U/mg/min
- 在pBAD33-WecPAh诱导表达时比活增至76±6 U/mg/min，提高约10倍
- 纯化的His6-WecP在5 ng和10 ng时分别达到150±12和224±17 U/mg/min，而GlcNAc掺入始终<1 U/mg/min。互补实验中，AH-3ΔwecP突变体无法合成O34抗原，但携带WecP可完全恢复
- E. coli wecA突变体MV501在共表达WecP和Gne（UDP-GalNAc 4-表异构酶）后恢复O7抗原合成，LPS糖分析检测到GalNAc且其含量与Man相当
- K. pneumoniae 52145ΔwecA在共表达WecP和Gne后恢复O1抗原，LPS中检测到GalNAc且无GlcNAc。序列分析表明WecP与WecA的氨基酸同一性<30%，相似性<50%，但与WbaP有相似的膜拓扑结构（N端4个跨膜螺旋、中央周质环、C端胞质尾）。
研究结论
WecP是一种新的UDP-HexNAc:polyprenol-P GalNAc-1-P转移酶，代表该酶家族的一个新亚组，在Wzy依赖的O抗原合成途径中特异性起始GalNAc-1-P向Und-P的转移。