高级醇 · 代谢工程文献库

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The Nonmevalonate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis in Mycobacterium tuberculosis Is Essential and Transcriptionally Regulated by Dxs

作者
Amanda C. Brown, Matthias Eberl, Dean C. Crick, Hassan Jomaa, Tanya Parish
单位
Barts and the London School of Medicine and Dentistry, Queen Mary University of London; Department of Infection, Immunity, and Biochemistry, School of Medicine, Cardiff University; Department of Microbiology, Immunology, and Pathology, Colorado State University; Institut für Klinische Immunologie und Transfusionsmedizin, Universitätsklinikum Giessen und Marburg; Infectious Disease Research Institute
杂志
Journal of Bacteriology（2010）
DOI
10.1128/JB.01402-09
所属领域
代谢工程
关键词
DOXP pathwayMycobacterium tuberculosisisoprenoid biosynthesisnonmevalonate pathwaytranscriptional regulation
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解决的核心问题

明确结核分枝杆菌非甲羟戊酸（DOXP）途径中关键基因dxs1和gcpE的必需性，并揭示该途径的转录调控机制。

研究策略

采用基因敲除与互补、基因置换、过表达、RT-PCR、启动子-报告基因分析及HMB-PP生物学检测等方法，结合生长曲线与表型分析。

研究路线图

100%
研究问题：DOXP途径基因必需性与转录调控机制
策略：基因敲除/互补、过表达、RT-PCR、报告基因等系统验证
关键改造：dxs1/gcpE基因敲除与互补菌株构建（merodiploid系统）
关键改造：Dxs过表达与启动子活性检测（dxr-gcpE操纵子分析）
结果：dxs1/gcpE必需，dxr必需并定位功能起始位点
结果：过表达Dxs1上调dxr-gcpE转录，HMB-PP增加2倍
结果：dxr上游启动子活性高，gcpE无独立启动子（共转录）
结论：DOXP途径为结核菌必需，GcpE限速，Dxs调控通量
应用：DOXP途径为抗结核药物开发特异性靶点
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核心内容

该研究系统探究了结核分枝杆菌非甲羟戊酸（DOXP）途径关键基因的必需性及其转录调控机制。通过基因敲除与互补实验，作者发现dxs1和gcpE在野生型菌株中均无法被敲除（各尝试40个转化子均无缺失突变体），而在引入互补拷贝的merodiploid背景下可获得染色体缺失，基因置换实验进一步证实这三个基因均为生长必需。过表达dxs1或dxs2可抑制结核分枝杆菌生长，而过表达Dxr或GcpE则无此效应。定量分析显示，过表达Dxs1或GcpE可使HMB-PP水平较野生型增加约2倍，且Dxs1和Dxs2均可上调dxr转录约16倍，其中Dxs1还协同上调gcpE转录。启动子活性检测表明dxr上游区域具有显著活性（204±20 Miller单位），而gcpE上游无启动子活性，结合共转录分析确认dxr-gcpE等四个基因形成操纵子，并精确定位了Dxr的功能性翻译起始位点。这些结果证明DOXP途径是结核分枝杆菌生存必需的代谢通路，其中GcpE为限速酶，Dxs通过转录调控控制途径通量，为抗结核药物开发提供了特异性靶点。

创新点

首次证明dxs1和gcpE在结核分枝杆菌体外生长中必需；发现Dxs1过表达可通过上调dxr-gcpE操纵子转录而增加HMB-PP积累，揭示Dxs的转录调控作用；精确定位Dxr的功能性翻译起始位点并证实dxr-gcpE等四个基因共转录形成操纵子。

研究对象（6）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Mycobacterium tuberculosis H37Rv 非甲羟戊酸（DOXP）途径 dxs1 Dxs1 催化 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶，必需基因，过表达抑制生长且上调dxr操纵子转录
Mycobacterium tuberculosis H37Rv 非甲羟戊酸（DOXP）途径 dxs2 Dxs2 催化 Dxs同源物，无DOXP合酶活性，过表达仍抑制生长并影响dxr转录
Mycobacterium tuberculosis H37Rv 非甲羟戊酸（DOXP）途径 dxr Dxr 催化 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，必需，与gcpE等共转录形成操纵子
Mycobacterium tuberculosis H37Rv 非甲羟戊酸（DOXP）途径 gcpE GcpE 催化 HMB-PP合酶，必需，限速步骤，过表达使HMB-PP增加2倍
Escherichia coli 非甲羟戊酸（DOXP）途径 dxr Dxr 催化 过表达导致生长抑制，添加丙酮酸可部分缓解毒性
Mycobacterium smegmatis mc2155 非甲羟戊酸（DOXP）途径 dxr Dxr 催化 用于过表达分析，未观察到生长抑制

关键发现

  1. dxs1和gcpE在野生型结核分枝杆菌中均无法敲除（各尝试40个转化子均无缺失突变体），而在引入互补拷贝的merodiploid背景下可获得染色体缺失（dxs1为20/40，gcpE为23/40）
  2. dxr的必需性再次确认，单独缺失在野生型中不可得（40个转化子），merodiploid背景中19/40成功
  3. 基因置换实验证实三个基因均为生长必需。过表达dxs1或dxs2抑制结核分枝杆菌生长，而过表达dxr或gcpE不影响生长
  4. 在E. coli中过表达Dxr导致生长抑制，添加0.5%丙酮酸钠可部分缓解。过表达Dxs1或GcpE使HMB-PP水平较野生型增加约2倍
  5. 过表达Dxs1和Dxs2均可上调dxr转录（约16倍过表达水平），其中Dxs1还上调gcpE转录。启动子活性检测显示dxr上游区域有显著活性（204±20 Miller单位），而gcpE上游无启动子活性（2.2±0.4 vs 对照2.8±0.2 Miller单位）。Dxr的功能性翻译起始位点被确定为下游最远的缬氨酸密码子，该位点突变导致无法功能互补。

研究结论

非甲羟戊酸（DOXP）途径是结核分枝杆菌生存必需的代谢通路，其中GcpE是限速酶，Dxs通过转录调控控制途径通量；该途径可成为抗结核药物开发的特异性靶点。