AglS, a Novel Component of the Haloferax volcanii N-Glycosylation Pathway, Is a Dolichol Phosphate-Mannose Mannosyltransferase
- 作者
- Chen Cohen-Rosenzweig, Sophie Yurist-Doutsch, Jerry Eichler
- 单位
- Department of Life Sciences, Ben Gurion University of the Negev, Beersheva, Israel
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2013）
- DOI
- 10.1128/JB.01716-12
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
确定Haloferax volcanii中HVO_1526（AglS）在N-糖基化通路中的功能，特别是其是否参与五糖最后甘露糖残基的添加。
研究策略
综合运用基因敲除、质谱分析、生物信息学预测和体外生化实验，验证AglS作为DolP-甘露糖甘露糖基转移酶催化甘露糖从DolP-甘露糖转移到蛋白结合的四糖上。
核心内容
本研究通过基因敲除、质谱分析、生物信息学预测和体外生化实验，鉴定并验证了盐古菌Haloferax volcanii中HVO_1526（命名为AglS）在N-糖基化通路中的功能。AglS是一个含9个跨膜域的约50.5 kDa多跨膜蛋白。敲除aglS后，S层糖蛋白Asn-13连接的五糖（m/z 1,224.48）消失，仅检测到四糖（m/z 1,143.45）及更短的糖链；回补表达该基因可恢复五糖组装。体外实验中，将纤维素结合CBD-AglS融合蛋白与ΔaglS膜片段共孵育3小时后，四糖成功转化为五糖，而单独CBD或CBD-SecY无此活性；且该转化依赖DolP-甘露糖供体，但不依赖AglR。生物信息学分析显示AglS与古菌DolP-甘露糖蛋白O-甘露糖基转移酶（CAZy家族39）有同源性，但缺少其保守的催化基序，更类似真核Alg3/Alg9/Alg12等DolP-甘露糖甘露糖基转移酶。结果表明，AglS是负责将甘露糖从DolP-甘露糖转移到蛋白结合四糖上以完成五糖组装的甘露糖基转移酶，该反应发生在细胞外表面。
创新点
首次鉴定AglS为DolP-甘露糖甘露糖基转移酶，阐明了S层糖蛋白五糖组装中最后一个甘露糖添加的机制；通过体内和体外实验共同验证了其功能。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Haloferax volcanii | N-糖基化通路 | HVO_1526 (aglS) | AglS | 催化 | 多跨膜膜蛋白，DolP-甘露糖甘露糖基转移酶，催化甘露糖从DolP-甘露糖转移到蛋白结合的四糖上 |
| Haloferax volcanii | N-糖基化通路 | aglD | AglD | 催化 | DolP-甘露糖合酶，负责将甘露糖加载到DolP载体上；ΔaglD细胞缺乏DolP-甘露糖，无法支持AglS介导的甘露糖转移 |
| Haloferax volcanii | N-糖基化通路 | aglR | AglR | 转运 | 被推测参与DolP-甘露糖跨膜翻转；体外实验中ΔaglR膜仍能支持AglS功能，表明甘露糖转移不依赖AglR |
| Haloferax volcanii | N-糖基化通路 | aglB | AglB | 催化 | 寡糖转移酶，将四糖从DolP载体转移到S层糖蛋白的Asn残基上 |
| Haloferax volcanii | N-糖基化通路 | aglF | AglF | 催化 | 葡萄糖-1-磷酸尿苷酰转移酶，参与糖核苷酸前体合成 |
关键发现
- HVO_1526编码一个约50.5 kDa（457个氨基酸）的多跨膜蛋白，含9个跨膜域，N端位于胞质；CBD-AglS融合蛋白在免疫印迹中显示约68 kDa条带（CBD 17,215 Da + HVO_1526 50,525 Da）。
- 缺失HVO_1526后，S层糖蛋白Asn-13连接的五糖（m/z 1,224.48）消失，仅检测到四糖（m/z 1,143.45）、三糖（m/z 1,048.42）、二糖（m/z
- 41）和单糖（m/z
- 38）；回补表达polyhistidine-tagged HVO_1526可恢复五糖。
- 体外实验表明，纤维素结合CBD-AglS与ΔaglS膜片段共孵育3小时后，四糖被转化为五糖；单独CBD或CBD-SecY无此活性；使用ΔaglD膜（缺乏DolP-甘露糖）时无五糖生成；使用ΔaglR膜时五糖生成正常。
- 生物信息学psiBLAST显示AglS与多个古菌DolP-甘露糖-蛋白O-甘露糖基转移酶（CAZy家族39）有同源性，但AglS缺少保守的Asp-Glu催化基序和跨膜域2中的Arg残基，更类似于真核Alg3/Alg9/Alg12等DolP-甘露糖甘露糖基转移酶。
研究结论
AglS（HVO_1526）是Haloferax volcanii N-糖基化通路中的DolP-甘露糖甘露糖基转移酶，负责将甘露糖从DolP-甘露糖转移到S层糖蛋白结合的四糖上，从而完成五糖组装；该反应发生在细胞外表面，不依赖于AglR。