Biosynthesis of Isoprenoid Wax Ester in Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798: Identification and Characterization of Isoprenoid Coenzyme A Synthetase and Wax Ester Synthases

作者: Erik Holtzapple, Claudia Schmidt-Dannert
单位: Department of Biochemistry, Molecular Biology and Biophysics, University of Minnesota
杂志: Journal of Bacteriology（2007）
DOI: 10.1128/JB.01932-06
所属领域: 代谢工程
关键词: CoA synthetaseMarinobacter hydrocarbonoclasticusWS/DGATisoprenoid wax esterphytolwax ester synthase
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解决的核心问题

鉴定并表征海洋细菌Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798中以植醇为碳源合成异戊二烯蜡酯的关键酶，即异戊二烯CoA合成酶和蜡酯合酶。

研究策略

利用近缘菌株M. aquaeolei VT8的基因组序列进行同源搜索，从DSM 8798中克隆候选基因，在大肠杆菌中异源表达纯化，通过体外酶活测定和产物分析（HPLC、LC-MS、TLC、GC-MS）表征酶学特性。

研究路线图

100%

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核心内容

该研究以海洋细菌Marinobacter hydrocarbonoclasticus DSM 8798为对象，鉴定并表征了以植醇为碳源合成异戊二烯蜡酯的关键酶。作者利用近缘菌株M. aquaeolei VT8基因组序列进行同源搜索，从DSM 8798中克隆出4个CoA合成酶（Acs1–Acs4）和4个蜡酯合酶（WS1–WS4），在大肠杆菌中异源表达纯化后，通过HPLC、LC-MS、TLC和GC-MS分析酶学特性。结果显示Acs2能特异性活化植烷酸生成植烷酰-CoA，而Pseudomonas putida的FadD无此功能；WS1和WS2能催化植烷酰-CoA与植醇或法尼醇缩合生成异戊二烯蜡酯，WS3无活性，WS4为假基因。其中WS2活性最高，以棕榈酰-CoA和十六醇为底物时比活达61.323 mmol min⁻¹ mg⁻¹，分别是WS1和Acinetobacter WS/DGAT的约46倍和158倍，其Km为44 μM，kcat为4794 s⁻¹。研究首次鉴定出异戊二烯特异性CoA合成酶及能高效合成异戊二烯蜡酯的蜡酯合酶，揭示了该菌利用海洋环境中丰富异戊二烯醇类底物合成储存脂质的途径，为异戊二烯蜡酯的微生物合成提供了酶学基础。

创新点

首次鉴定出异戊二烯特异性CoA合成酶（Acs2）和两种能合成异戊二烯蜡酯的蜡酯合酶（WS1、WS2）；证明了WS2对酰基底物的活性比已知酰基WS高几个数量级；发现Acinetobacter WS/DGAT不能利用异戊二烯底物。

研究对象（8）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
E. coli	异戊二烯蜡酯生物合成	acs1	Acs1	催化	中链脂酰-CoA合成酶，活化C10-C16脂肪酸；来源于M. hydrocarbonoclasticus DSM 8798
E. coli	异戊二烯蜡酯生物合成	acs2	Acs2	催化	异戊二烯/脂酰-CoA合成酶，能活化植烷酸；与P. putida FadD有64%序列同一性
E. coli	异戊二烯蜡酯生物合成	acs3	Acs3	催化	长链脂酰-CoA合成酶，活化C12-C20脂肪酸；来源于M. hydrocarbonoclasticus DSM 8798
E. coli	异戊二烯蜡酯生物合成	acs4	Acs4	催化	长链脂酰-CoA合成酶，活化C12-C20脂肪酸；来源于M. hydrocarbonoclasticus DSM 8798
E. coli	异戊二烯蜡酯生物合成	ws1	WS1	催化	异戊二烯蜡酯合酶，同时具有DGAT活性；与ADP1 WS/DGAT有45%同源性
E. coli	异戊二烯蜡酯生物合成	ws2	WS2	催化	异戊二烯蜡酯合酶，活性远高于已知WS；与ADP1 WS/DGAT有38%同源性
E. coli	异戊二烯蜡酯生物合成	ws3	WS3	催化	克隆的WS3，未检测到酯合酶活性；与ADP1 WS/DGAT有27%同源性
E. coli	异戊二烯蜡酯生物合成	ws4	WS4	催化	假基因，含有终止密码子导致ORF截短；与ADP1 WS/DGAT有25%同源性

关键发现

从M. hydrocarbonoclasticus DSM 8798中克隆了4个CoA合成酶（Acs1-Acs4）和4个蜡酯合酶（WS1-WS4），序列与M. aquaeolei VT8同源物同一性>97%。其中Acs2（与P. putida FadD有64%同源性）能特异性活化植烷酸生成植烷酰-CoA（LC-MS确认产物m/z 1062），而P. putida FadD不能。WS1和WS2均能催化植烷酰-CoA与植醇/法尼醇合成异戊二烯蜡酯（GC-MS确认产物分子量590 m/z），WS3无活性，WS4为假基因。WS2比活最高：以棕榈酰-CoA+十六醇为底物时比活为61.323 mmol min-1 mg-1，是WS1（1.338 mmol min-1 mg-1）的约46倍，是Acinetobacter WS/DGAT（0.389 mmol min-1 mg-1）的约158倍
以棕榈酰-CoA+植醇为底物时WS2比活为28.872 mmol min-1 mg-1
以植烷酰-CoA+植醇为底物时WS2比活为0.397 mmol min-1 mg-1。WS2动力学参数：Km=44 μM，Vmax=10 mmol min-1 mg-1，kcat=4794 s-1。WS2偏好C16酰基-CoA，C14活性低，C12不被接受
醇底物谱较宽。WS1具有DGAT活性，WS2无。

研究结论

本研究阐明M. hydrocarbonoclasticus DSM 8798通过异戊二烯CoA合成酶和蜡酯合酶合成异戊二烯蜡酯的途径，其中Acs2负责活化植烷酸，WS1和WS2催化植烷酰-CoA与植醇或法尼醇缩合生成异戊二烯蜡酯。WS2的高活性表明其在细胞条件下能高效合成储存脂质，这些酶可能适应了海洋环境中丰富的异戊二烯醇类底物。