Enterococcus faecalis Acetoacetyl-Coenzyme A Thiolase/3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-Coenzyme A Reductase, a Dual-Function Protein of Isopentenyl Diphosphate Biosynthesis
- 作者
- Matija Hedl, Autumn Sutherlin, E. Imogen Wilding, Marie Mazzulla, Damien McDevitt, Pamela Lane, John W. Burgner II, Kevin R. Lehnbeuter, Cynthia V. Stauffacher, Michael N. Gwynn, Victor W. Rodwell
- 单位
- Departments of Biochemistry, Purdue University; Department of Biological Sciences, Purdue University; Microbial, Musculoskeletal, and Proliferative Diseases Center of Excellence and Drug Discovery, GlaxoSmithKline Pharmaceuticals
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2002）
- DOI
- 10.1128/JB.184.8.2116-2122.2002
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
肠球菌中甲羟戊酸途径的关键酶mvaE基因是否编码真正的双功能蛋白（乙酰乙酰辅酶A硫解酶和HMG-CoA还原酶），以及该双功能酶的酶学性质。
研究策略
从粪肠球菌克隆mvaE基因，在E. coli中表达并纯化His标签融合蛋白；通过Western印迹验证肠球菌体内表达为单一多肽；对两种催化活性进行温度、pH、动力学参数、辅酶特异性和抑制剂研究；用二乙基焦碳酸酯（DEPC）修饰鉴定活性位点组氨酸。
核心内容
该研究从粪肠球菌中克隆了甲羟戊酸途径的mvaE基因，并在大肠杆菌中表达纯化其His标签融合蛋白，通过Western印迹确认该基因在肠球菌体内以单一多肽形式存在。酶学表征表明该蛋白为约83.5 kDa的双功能酶，兼具乙酰乙酰辅酶A硫解酶和HMG-CoA还原酶活性。硫解酶合成反应最适pH 10.5，硫解最适pH 9.5，合成乙酰乙酰辅酶A时乙酰CoA的Km为0.60 mM；HMG-CoA还原酶还原HMG-CoA时Km为20 μM，且严格依赖NADPH而非NADH，是目前已知唯一NADPH特异的II类HMG-CoA还原酶。氟伐他汀竞争性抑制该还原酶活性（Ki=0.5 mM），证实其属于II类酶。二乙基焦碳酸酯修饰实验提示活性位点组氨酸（预测His756）参与第一步还原反应。该研究首次报道了HMG-CoA还原酶以天然融合形式与硫解酶共存，鉴于甲羟戊酸途径对革兰阳性球菌生长至关重要，这一双功能酶可作为抗菌药物开发的潜在靶点。
创新点
首次证明HMG-CoA还原酶天然融合于另一个酶（乙酰乙酰辅酶A硫解酶），是第一个双功能的异戊烯基焦磷酸生物合成酶；发现粪肠球菌HMG-CoA还原酶是目前唯一NADPH特异的II类HMG-CoA还原酶。
研究对象（5）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Enterococcus faecalis | 甲羟戊酸途径 | mvaE | 乙酰乙酰辅酶A硫解酶 | 催化 | 双功能蛋白的N端活性，催化乙酰辅酶A缩合为乙酰乙酰辅酶A（第一步反应） |
| Enterococcus faecalis | 甲羟戊酸途径 | mvaE | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | 双功能蛋白的C端活性，催化HMG-CoA还原为甲羟戊酸，II类HMG-CoA还原酶，NADPH特异 |
| Enterococcus faecium | 甲羟戊酸途径 | mvaE | mvaE基因产物 | 催化 | Western印迹证实以单一多肽存在，未发生翻译后切割 |
| Enterococcus hirae | 甲羟戊酸途径 | mvaE | mvaE基因产物 | 催化 | Western印迹证实以单一多肽存在，未发生翻译后切割 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 甲羟戊酸途径 | mvaE | mvaE基因产物（His标签） | 催化 | 用于表达重组蛋白，经镍亲和纯化后用于酶学表征 |
关键发现
- mvaE基因产物为83.5 kDa（计算86,496 Da），在E. faecalis、E. faecium和E. hirae中以单一多肽形式存在。纯化蛋白纯度>95%，产量平均10 mg/L。乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性：合成最适pH
- 5，硫解最适pH
- 5，最适温度均约37°C；硫解ΔH_a=5.3 kcal；合成乙酰乙酰辅酶A时Km乙酰CoA=0.60 mM，硫解时Km乙酰乙酰CoA=88 μM，Km CoA=10 μM；Vmax分别为85和1250 eu/mg；CoA竞争性抑制合成反应，Ki=0.12 mM，Ki/Km=0.19。HMG-CoA还原酶活性：最适pH
- 5（还原HMG-CoA）、7.0（还原甲羟戊醛）、8.0（氧化甲羟戊醛）、9.3（氧化甲羟戊酸）；最适温度37°C，ΔH_a=14 kcal；以NADPH/NADP+为辅酶，NADH无活性；动力学参数：反应3 HMG-CoA Km=20 μM，NADPH Km=30 μM；反应4甲羟戊醛Km=3.8 mM；反应5甲羟戊醛Km=660 μM，CoA Km=220 μM；反应6甲羟戊酸Km=1 mM；氟伐他汀竞争性抑制反应3，Ki=0.5 mM，表明为II类HMG-CoA还原酶；DEPC使反应3失活但反应4不受影响，且羟胺可恢复活性，提示活性位点组氨酸（预测His756）参与第一步还原。
研究结论
mvaE基因产物是真正的双功能蛋白，同时具有乙酰乙酰辅酶A硫解酶和HMG-CoA还原酶活性，是肠球菌异戊烯基焦磷酸生物合成的关键酶。该HMG-CoA还原酶属于II类，对NADPH特异，且融合结构是首次报道；鉴于甲羟戊酸途径对革兰阳性球菌生长必需，该双功能酶可作为抗菌药物开发靶点。