GcpE Is Involved in the 2-C-Methyl-D-Erythritol 4-Phosphate Pathway of Isoprenoid Biosynthesis in Escherichia coli
- 作者
- Boran Altincicek, Ann-Kristin Kollas, Silke Sanderbrand, Jochen Wiesner, Martin Hintz, Ewald Beck, Hassan Jomaa
- 单位
- Institute of Biochemistry, Academic Hospital Centre, Justus Liebig University
- 杂志
- Journal of Bacteriology（2001）
- DOI
- 10.1128/JB.183.8.2411-2416.2001
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明大肠杆菌MEP途径中gcpE基因的功能，验证其参与异戊二烯生物合成的MEP途径
研究策略
构建含酵母甲羟戊酸途径基因的合成操纵子使大肠杆菌能利用外源甲羟戊酸合成IPP，在此基础上敲除gcpE基因，通过观察对甲羟戊酸的依赖性及回补实验证明gcpE参与MEP途径
核心内容
该研究通过构建含有酿酒酵母甲羟戊酸途径三基因（甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶）的合成操纵子，使大肠杆菌能够利用外源甲羟戊酸合成异戊烯焦磷酸，从而绕开内源MEP途径。在此基础上，利用pKO3载体对gcpE基因进行精确框内敲除，并通过生长表型分析和回补实验验证其功能。结果显示，gcpE敲除突变株仅在补充100 μM甲羟戊酸时才能生长，与已知MEP途径基因dxr敲除株的行为一致；回补含gcpE的质粒后，突变株可在无甲羟戊酸培养基上恢复生长，证明gcpE是MEP途径的必需基因。PCR验证确认敲除成功，产物从野生型的1600 bp变为530 bp。该研究明确了GcpE参与大肠杆菌异戊二烯生物合成的MEP途径，但具体生化功能有待进一步阐明。
创新点
构建了由酵母甲羟戊酸激酶（Mvk）、磷酸甲羟戊酸激酶（Pmk）和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶（Mpd）组成的三基因合成操纵子，使大肠杆菌能利用外源甲羟戊酸；利用pKO3载体对gcpE进行精确框内敲除
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli K-12 (DSM 498, ATCC 23716) | MEP途径 | gcpE | GcpE | 催化 | 参与MEP途径的未知催化步骤，基因敲除后需外源甲羟戊酸才能存活 |
| Escherichia coli K-12 | MEP途径 | dxr | Dxr (DOXP reductoisomerase) | 催化 | 催化DOXP转化为MEP，作为对照基因敲除验证方法 |
| Saccharomyces cerevisiae (BJ1991) | 甲羟戊酸途径 | ERG12 (mvk) | Mvk (mevalonate kinase) | 催化 | 合成操纵子中的酵母基因，使大肠杆菌能利用外源甲羟戊酸 |
| Saccharomyces cerevisiae (BJ1991) | 甲羟戊酸途径 | ERG8 (pmk) | Pmk (phosphomevalonate kinase) | 催化 | 合成操纵子中的酵母基因 |
| Saccharomyces cerevisiae (BJ1991) | 甲羟戊酸途径 | MVD1 (mpd) | Mpd (mevalonate pyrophosphate decarboxylase) | 催化 | 合成操纵子中的酵母基因 |
| Escherichia coli | MEP途径 | dxs | Dxs (DOXP synthase) | 催化 | 催化丙酮酸和甘油醛-3-磷酸缩合生成DOXP |
| Escherichia coli | MEP途径 | ipi | Ipi (IPP isomerase) | 催化 | IPP与DMAPP互变 |
| Escherichia coli | MEP途径 | ygbP, ychB, ygbB | YgbP, YchB, YgbB | 催化 | 催化MEP转化生成2-C-甲基-D-赤藓醇2,4-环二磷酸 |
| Escherichia coli | MEP途径 | lytB | LytB | 催化 | 催化MEP途径分支点或下游步骤 |
| Escherichia coli | MEP途径 | yfgA | YfgA | 调控 | 推测与gcpE共转录，可能为转录调控因子 |
关键发现
- gcpE基因敲除突变株（wt ΔgcpE）仅在外源补充100 μM mevalonate时才能生长，与dxr敲除突变株（wt Δdxr）行为一致
- 回补含gcpE的质粒后，突变株可在无甲羟戊酸培养基上恢复生长
- 含合成甲羟戊酸操纵子的大肠杆菌在100-200 μM mevalonate存在下对fosmidomycin具有抗性，可存活
- gcpE基因敲除通过PCR验证，PCR产物大小从野生型1600 bp变为530 bp（减少1070 bp）
- gcpE基因全长1116 bp。
研究结论
GcpE是E. coli中MEP途径的一个必需酶，参与异戊二烯生物合成，但其精确的生化功能仍需进一步研究。