Duplicate Isochorismate Synthase Genes of Bacillus subtilis: Regulation and Involvement in the Biosyntheses of Menaquinone and 2,3-Dihydroxybenzoate
- 作者
- Belinda M. Rowland, Harry W. Taber
- 单位
- 奥尔巴尼医学院微生物学、免疫学和分子遗传学系，奥尔巴尼，纽约州 12208；纽约州卫生部沃兹沃思中心，纽约州立大学奥尔巴尼分校公共卫生学院生物医学科学系，奥尔巴尼，纽约州 12201-2002
- 杂志
- Journal of Bacteriology（1996）
- DOI
- 10.1128/jb.178.3.854-861.1996
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
阐明枯草芽孢杆菌中两个异分支酸合成酶基因 menF 和 dhbC 在甲萘醌（MK）和铁载体 2,3-二羟基苯甲酸（DHB）生物合成中的各自作用及铁浓度调控机制
研究策略
构建 menF 和 dhbC 的框内缺失突变体及双缺失突变体，通过薄层层析和 DHB 比色测定分析产物合成；使用 lacZ 融合、引物延伸和 RNase 保护实验分析转录调控；对 dhb 启动子中的 iron box 进行定点突变以验证 Fur 样阻遏调控
核心内容
该研究通过构建枯草芽孢杆菌menF和dhbC的框内缺失及双缺失突变体，系统阐明了两个异分支酸合成酶基因在甲萘醌（MK）和铁载体2,3-二羟基苯甲酸（DHB）生物合成中的分工与调控机制。结果显示，menF缺失株仍能产生野生型水平的MK和DHB，而dhbC缺失株MK合成正常但DHB严重缺陷（A510/OD600仅0.025，接近铁抑制水平），双缺失株则完全丧失MK7合成能力且DHB极低（0.005），表明两者功能冗余但不对称：dhbC可补偿menF缺失，反之则不能。转录分析发现menF表达不受铁浓度影响，而dhbC在添加5 μM FeCl3时转录完全被抑制；对dhb启动子iron box进行定点突变后铁调控被废除，证实存在Fur样阻遏蛋白介导的铁响应。这些结果揭示了细菌通过基因重复实现功能分化与适应性调控的策略，即MenF专司MK合成、DhbC专司铁载体合成并受铁浓度严格调控。
创新点
首次系统证明 menF 和 dhbC 功能冗余但不对称——dhbC 可补偿 menF 缺失用于 MK 合成，而 menF 不能补偿 dhbC 缺失用于 DHB 合成；发现 dhbC 转录受铁浓度调节，其启动子 iron box 序列与大肠杆菌 Fur 结合位点一致，突变后铁调控消失，提示枯草芽孢杆菌存在 Fur 样阻遏蛋白
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Bacillus subtilis 168 (RB1) | 甲萘醌生物合成 | menF | MenF (异分支酸合成酶) | 催化 | 位于甲萘醌基因簇启动子近端；表达不受铁浓度调控；缺失后可由 DhbC 互补 |
| Bacillus subtilis 168 (RB1) | 2,3-二羟基苯甲酸（DHB）生物合成 | dhbC | DhbC (异分支酸合成酶) | 催化 | 位于 DHB 基因簇第二个基因；表达受铁浓度调控，铁缺乏时诱导；缺失导致 DHB 缺乏，MenF 不能互补 |
| Bacillus subtilis 168 (RB1) | 铁调控（dhb 操纵子） | — | Fur样阻遏蛋白（推测） | 调控 | 推测存在于枯草芽孢杆菌；通过结合 dhb 启动子中的 iron box 序列（GATAATGATAATCATTATC）抑制转录；iron box 突变废除铁调控 |
关键发现
- menF 缺失株（RB1120 等）产生野生型水平的 MK 和 DHB（DHB A510/OD600 为
- 15～0.3，与野生型相似）；dhbC 缺失株 RB1255 产生野生型水平 MK，但 DHB 缺陷（A510/OD600 为
- 025，接近加 5 μM FeCl3 时的抑制水平
- 02～0.04）；双缺失株 RB1250 的 MK7 薄层色谱检测不到，DHB 极低（A510/OD600 为
- 005）。menF 表达不受铁影响（LB 中添加 200 μM α,α'-联吡啶或 20 μM FeSO4 时 β-半乳糖苷酶活性曲线相似），而 dhbC 转录在添加 5 μM FeCl3 时完全被抑制（引物延伸和 RNase 保护实验）；将 dhb 启动子 iron box 的 8/9 个保守碱基突变后，铁调控被废除，但基础表达水平略有下降。
研究结论
枯草芽孢杆菌的两个异分支酸合成酶基因 menF 和 dhbC 分别服务于不同的生理需求：MenF 参与甲萘醌生物合成，表达不受铁浓度调控；DhbC 参与铁载体 DHB 生物合成，严格受铁浓度调控（通过 Fur 样阻遏蛋白结合 iron box）。两者功能冗余但不对称，dhbC 是 DHB 合成所必需，而 menF 缺失可由 dhbC 补偿，这体现了细菌对环境条件的适应性分化。