Engineering of Secondary Metabolism
- 作者
- Sarah E. O'Connor
- 单位
- The John Innes Centre, Norwich Research Park, Norwich NR4 7UH, United Kingdom
- 杂志
- Annual Review of Genetics（2015）
- DOI
- 10.1146/annurev-genet-120213-092053
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
次级代谢产物是药物和工业产品的重要来源，但天然产量低、结构复杂，难以通过化学合成获取。论文旨在综述通过代谢工程手段改造次级代谢途径，实现高价值天然产物的高效生产、结构多样化以及改善宿主表型。
研究策略
采用批判性综述的方法，系统评估异源宿主（链霉菌、大肠杆菌、酵母、本氏烟草）中的途径重建策略、天然宿主中的途径增强与沉默基因簇激活策略、代谢途径的区室化定位工程策略，以及通过突变合成、酶交换和酶工程产生非天然产物的策略。
核心内容
该综述系统梳理了代谢工程在次级代谢产物高效生产与结构多样化中的应用策略。作者从异源宿主重建、天然宿主途径增强、基因簇激活以及代谢途径区室化等多个层面展开评述，重点比较了链霉菌、大肠杆菌、酵母和本氏烟草等宿主的适用性与代表性案例。关键结果表明，通过强化前体供应和优化异源表达，多种高价值产物实现了可观产量：紫杉二烯在大肠杆菌中达1 g/L，青蒿酸在酵母中从100 mg/L提升至25 g/L并实现商业化；质体定位可使倍半萜产量提高1000倍，线粒体定位使酵母倍半萜产量提升20倍，展示了区室化作为代谢工程新兴维度的巨大潜力。此外，利用聚酮合酶结构域交换和NRPS A域改造等酶工程手段，能够生成非天然产物，拓宽了次级代谢产物的化学空间。该工作表明代谢工程不仅能显著提升天然产物产量，还通过策略组合为复杂化合物的可持续供给和结构创新提供了可行路径。
创新点
1. 系统归纳了四种异源宿主的适用性和关键案例；2. 强调区室化是代谢工程的新兴关键维度，展示了质体和线粒体定位显著提高产量的实例；3. 总结了通过酶工程（如聚酮合酶结构域交换、NRPS A域改造）和组合生物合成创造非天然产物的途径。
研究对象（39）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces parvus | 放线紫红素生物合成 | act gene cluster | 聚酮合酶 | 催化 | 首个异源重建的聚酮类抗生素，由Hopwood等报道 |
| Streptomyces coelicolor | 6-脱氧红霉内酯B生物合成 | DEBS | 6-脱氧红霉内酯B合酶（模块化聚酮合酶） | 催化 | 产量40 mg/L |
| Escherichia coli | 红霉素生物合成 | DEBS及脱氧糖/修饰基因（17个） | 聚酮合酶和修饰酶 | 催化 | 红霉素C <1 mg/L，红霉素A约10 mg/L |
| Escherichia coli | 紫杉二烯生物合成 | taxadiene synthase | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 产量1 g/L |
| Escherichia coli | 紫杉烷羟基化 | — | 细胞色素P450 | 催化 | 约100 mg/L羟基化紫杉二烯中间体 |
| Escherichia coli | 无青素（amorphadiene）生物合成 | amorphadiene synthase, MVA pathway genes | 无青素合酶 | 催化 | 产量300 mg/L |
| Escherichia coli | 青蒿酸生物合成 | CYP71AV1 | 细胞色素P450氧化酶 | 催化 | 青蒿酸产量100 mg/L |
| Escherichia coli | 苄基异喹啉生物碱（reticuline）生物合成 | 5个异源基因 | 多种酶（如多巴脱羧酶等） | 催化 | 从外源多巴胺产量>10 mg/L |
| Escherichia coli | 苄基异喹啉生物碱（reticuline）从头合成 | 来自细菌和哺乳动物的多个基因 | 多种酶 | 催化 | 从甘油产量6 mg/L |
| Escherichia coli | 黄酮类（类黄酮）生物合成 | — | 植物来源的酶（如查尔酮合酶等） | 催化 | 柚皮素产量84 mg/L（从葡萄糖） |
| Escherichia coli | 芪类（白藜芦醇）生物合成 | — | 白藜芦醇合酶 | 催化 | 产量2.3 g/L（增强丙二酰辅酶A池） |
| Saccharomyces cerevisiae | 青蒿酸生物合成 | 酵母MVA通路基因、amorphadiene synthase、CYP71AV1等 | 多种酶 | 催化 | 优化后产量达25 g/L（商业化） |
| Saccharomyces cerevisiae | 单萜吲哚生物碱（strictosidine）生物合成 | 21个外源基因 | 多种酶 | 催化 | 产量0.5 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 苄基异喹啉生物碱（二氢异喹啉等）生物合成 | 10基因通路 | 多种酶 | 催化 | 从去甲乌药碱产率1.5% |
| Saccharomyces cerevisiae | 芪类（白藜芦醇）生物合成 | 白藜芦醇合酶等 | 白藜芦醇合酶 | 催化 | 从对香豆酸约300 μg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 黄酮类（柚皮素）生物合成 | 苯丙烷途径三个基因 | 多种酶 | 催化 | 柚皮素产量约7 mg/L |
| Saccharomyces cerevisiae | 真菌聚酮（洛伐他汀）生物合成 | lovastatin polyketide synthase (来自Aspergillus terreus) | 多功能聚酮合酶 | 催化 | 产量约1–15 mg/L |
| Nicotiana benthamiana | 硫代葡萄糖苷（glucoraphanin）生物合成 | 14个基因（含CYP79、CYP83等） | 多种酶 | 催化 | 产量0.4 μmol/g干重 |
| Nicotiana benthamiana | 单萜吲哚生物碱（strictosidine）生物合成 | 10个通路基因+2个前体供给基因 | 多种酶 | 催化 | 得到strictosidine前体，内源酶会衍生化中间体 |
| Nicotiana benthamiana | 青蒿素生物合成 | 来自植物/酵母的MVA和青蒿素途径基因 | 多种酶 | 催化 | 瞬时表达青蒿酸产量4 μg/kg鲜重 |
| Nicotiana benthamiana | 三萜生物合成 | 燕麦三萜基因簇的三个基因 | 环化酶、P450、糖基转移酶 | 催化 | 产量40 nmol/mg鲜重 |
| Solanum lycopersicum (番茄) | 类黄酮生物合成 | 矮牵牛查尔酮异构酶 | 查尔酮异构酶 | 催化 | 果皮黄酮醇增加78倍 |
| Mentha × piperita (薄荷) | 单萜生物合成 | 沉默不良单萜合酶，过表达MEP通路基因 | 单萜合酶等 | 催化 | 精油产量提高60%（田间试验） |
| Arabidopsis thaliana | 花青素生物合成 | 玉米R和C1转录因子 | R（bHLH）、C1（MYB） | 调控 | 异源表达激活花青素产生 |
| Rosa (玫瑰) | 苯丙烷和萜类生物合成 | 拟南芥PAP1转录因子 | MYB转录因子 | 调控 | 上调花香和颜色相关物质 |
| Arabidopsis thaliana | 硫代葡萄糖苷转运 | NRT/PTR转运蛋白基因 | NRT/PTR转运蛋白 | 转运 | 敲低后种子中检测不到硫代葡萄糖苷 |
| Nicotiana tabacum (烟草) | 倍半萜生物合成 | 倍半萜合酶（定位质体） | 倍半萜合酶 | 催化 | 质体定位使产量提高1000倍（对比胞质） |
| Nicotiana tabacum (烟草) | 三萜生物合成 | 两个三萜合酶（定位质体） | 三萜合酶 | 催化 | 质体定位使产量提高90倍 |
| Saccharomyces cerevisiae | 倍半萜生物合成 | 倍半萜合酶（定位线粒体） | 倍半萜合酶 | 催化 | 线粒体定位使产量提高20倍 |
| Nicotiana tabacum (烟草) | MVA途径（异戊二烯前体） | 六基因MVA通路（转移至质体） | MVA通路酶 | 催化 | 质体定位提高萜类产量 |
| Streptomyces coeruleorubidus | 抗生素生物合成（氯化） | 外源氯代酶基因 | 氯代酶 | 催化 | 产生天然抗生素的氯代类似物 |
| 植物培养细胞（如长春花） | 生物碱生物合成（卤化） | 细菌卤化酶基因 | 卤化酶 | 催化 | 产生氯代和溴代生物碱 |
| Escherichia coli | 聚酮生物合成（氟化） | 氟化酶和氟丙二酰辅酶A合成基因 | 氟化相关酶、聚酮合酶 | 催化 | 生成氟化6-脱氧红霉内酯B中间体 |
| Saccharomyces cerevisiae | 聚酮生物合成（组合生物合成） | 真菌聚酮合酶基因（随机配对） | 真菌聚酮合酶 | 催化 | 产生新骨架分子，含前所未有的结构 |
| Escherichia coli | 聚酮生物合成（红霉素类似物） | DEBS AT域交换 | 聚酮合酶（改造） | 催化 | 产生红霉素类似物 |
| Escherichia coli | 非核糖体肽生物合成 | AdmK（A域） | NRPS腺苷化域 | 催化 | 定向进化改变底物特异性 |
| Escherichia coli | 羊毛硫抗生素生物合成 | 工程化羊毛硫抗生素合成酶 | 羊毛硫抗生素合成酶 | 催化 | 无需前导肽 |
| Streptomyces | 沉默基因簇激活 | — | 簇内调控蛋白 | 调控 | 组成型表达或缺失调控元件可激活沉默簇 |
| Aspergillus nidulans | 次级代谢 | 组蛋白甲基化基因（缺失） | 组蛋白甲基转移酶 | 调控 | 去除后沉默基因簇被激活 |
关键发现
- 关键数据包括：6-脱氧红霉内酯B在变青链霉菌中产量40 mg/L
- 在大肠杆菌中红霉素C产量<1 mg/L、红霉素A约10 mg/L
- 紫杉二烯在大肠杆菌中1 g/L，羟基化紫杉二烯约100 mg/L
- 无青素(amorphadiene) 300 mg/L，青蒿酸100 mg/L
- 网状番荔枝碱(reticuline)从多巴胺>10 mg/L、从甘油6 mg/L
- 柚皮素84 mg/L，白藜芦醇2.3 g/L（增强丙二酰辅酶A）
- 青蒿酸在酵母中从100 mg/L优化至25 g/L（商业化水平）
- 严格嘧啶碱(strictosidine)在酵母中0.5 mg/L
- 二氢异喹啉类生物碱在酵母中产率1.5%
- 白藜芦醇在酵母中约300 μg/L，柚皮素约7 mg/L
- 真菌聚酮在酵母中约1–15 mg/L
- 硫代葡萄糖苷(glucoraphanin)在本氏烟草中0.4 μmol/g干重
- 青蒿酸在本氏烟草中4 μg/kg鲜重、稳定烟草中青蒿素7 μg/g干重
- 三萜在本氏烟草中40 nmol/mg鲜重
- 番茄果皮黄酮醇增加78倍
- 薄荷精油产量提高60%
- 质体定位使倍半萜产量提高1000倍、三萜提高90倍
- 线粒体定位使酵母倍半萜提高20倍
- 质体多顺反子表达提高10倍。
研究结论
代谢工程是提高次级代谢产物产量和实现结构多样化的有力工具。异源表达需要大量优化，但潜力巨大，青蒿素的商业化是成功案例。区室化策略能绕过天然调控，是未来发展的重点。宿主选择仍需更多经验指导。