Functional Characterization of Sesquiterpene Synthase from Polygonum minus
- 作者
- Su-Fang Ee, Zeti-Azura Mohamed-Hussein, Roohaida Othman, Noor Azmi Shaharuddin, Ismanizan Ismail, Zamri Zainal
- 单位
- School of Biosciences and Biotechnology, Faculty of Science and Technology, Universiti Kebangsaan Malaysia; Institute of Systems Biology (INBIOSIS), Universiti Kebangsaan Malaysia; Faculty of Biotechnology and Biomolecular Sciences, Universiti Putra Malaysia
- 杂志
- The Scientific World Journal（2014）
- DOI
- 10.1155/2014/840592
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
P. minus 中倍半萜合酶（PmSTS）的功能未知，且缺乏原生转化体系，需要通过异源表达表征其在植物中的功能。
研究策略
采用农杆菌介导的花序浸蘸法将 PmSTS 基因转入拟南芥（Columbia-0）过表达，通过分子鉴定（PCR、半定量RT-PCR）、表型观察和GC-MS挥发性产物分析，确定基因功能。
核心内容
从Polygonum minus中克隆得到倍半萜合酶基因PmSTS，其开放阅读框长1689 bp，编码562个氨基酸，预测分子量65.1 kDa。序列分析表明该酶含有DDXXD、NSE/DTE和RXR等保守基序，与Toona sinensis倍半萜合酶同源性最高（43%一致性），属于被子植物Tps-a亚家族。为了表征其功能，采用农杆菌介导的花序浸蘸法将PmSTS转入拟南芥Columbia-0进行过表达，通过PCR和半定量RT-PCR确认转基因株系后，利用GC-MS分析挥发性产物。结果显示，转基因株系OE3和OE7在保留时间20.834处出现额外峰，经鉴定为β-倍半萜水芹烯，证实PmSTS可催化FPP生成该倍半萜产物。同时，过表达植株表现出基生莲座叶变小、花茎缩短变少以及种子数减少一半的生长迟缓表型，暗示PmSTS过表达干扰了异戊二烯代谢，可能与赤霉素合成形成竞争。该研究首次在拟南芥中功能表达了P. minus的倍半萜合酶，并纠正了此前乳酸乳球菌表达系统中引入的K266E点突变，证明拟南芥可作为该植物倍半萜合酶基因功能研究的有效异源体系。
创新点
首次在拟南芥中功能性表达 P. minus 倍半萜合酶基因；纠正了此前在乳酸乳球菌表达中引入的 K266E 点突变；通过GC-MS证实产物为β-倍半萜水芹烯，并观察到过表达导致植物生长迟缓和种子减产，提示与赤霉素合成竞争。
研究对象（2）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Polygonum minus | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径） | PmSTS | PmSTS 倍半萜合酶 | 催化 | 基因来源植物，基因全长为1689 bp，编码562个氨基酸 |
| Arabidopsis thaliana | 倍半萜生物合成（甲羟戊酸途径） | PmSTS | PmSTS 倍半萜合酶 | 催化 | 异源过表达产生 β-倍半萜水芹烯，导致生长迟缓和种子减产 |
关键发现
- PmSTS 开放阅读框长1689 bp，编码562个氨基酸，预测分子量65.1 kDa，理论pI 5.29
- 其氨基酸序列与 Toona sinensis 倍半萜合酶同源性最高（43%一致性）
- 含有 DDXXD（314-318）、NSE/DTE（465-473）和 RXR（277-279）保守基序
- 3D模型中90.4%非甘氨酸/脯氨酸残基位于Ramachandran图最适区域
- 系统发育分析显示其属于被子植物倍半萜合酶 Tps-a 亚家族
- 转基因株系OE3和OE7表现出较小的基生莲座叶、更短更少的花茎、种子数减少一半
- GC-MS检测到保留时间20.834的额外峰，鉴定为β-倍半萜水芹烯。
研究结论
PmSTS 是一个功能性倍半萜合酶，负责催化 FPP 生成 β-倍半萜水芹烯；异源表达于拟南芥可行，过表达会干扰异戊二烯代谢导致植物生长发育迟缓；拟南芥可作为 P. minus 倍半萜合酶基因功能研究的有效体系。