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Inducing Effect of Dihydroartemisinic Acid in the Biosynthesis of Artemisinins with Cultured Cells of Artemisia annua by Enhancing the Expression of Genes

作者
Jianhua Zhu, Jiazeng Yang, Zihan Zeng, Wenjin Zhang, Liyan Song, Wei Wen, Rongmin Yu
单位
Biotechnological Institute of Chinese Materia Medica, Jinan University, Guangzhou 510632, China; College of Pharmacy, Jinan University, Guangzhou 510632, China
DOI
10.1155/2014/3190
所属领域
代谢工程
关键词
Artemisia annuaArtemisininbiosynthetic pathwaydihydroartemisinic acidgene expressionsuspension-cultured cells
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解决的核心问题

二氢青蒿酸（DHAA）作为青蒿素的直接前体，在青蒿悬浮培养细胞中是否能促进青蒿素及其类似物的生物合成，以及其分子机制是什么。

研究策略

采用前体饲喂策略，向青蒿悬浮培养细胞中添加DHAA，通过HPLC/GC-MS检测代谢产物，分离鉴定新化合物，并利用RT-PCR分析青蒿素生物合成关键基因的表达变化。

研究路线图

100%
研究问题：DHAA是否促进青蒿素生物合成及其分子机制
策略：前体饲喂青蒿悬浮细胞
关键改造：添加25 mg/L DHAA培养2天
结果：青蒿素产量达237.5 μg/L
基因上调：ADS 3.19倍/CYP71AV1 7.21倍/FPS 2.04倍
分离鉴定青蒿素及4个类似物
结论：DHAA经酶催化上调基因促青蒿素合成
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核心内容

该研究以青蒿悬浮培养细胞为对象，考察二氢青蒿酸（DHAA）对青蒿素类化合物生物合成的诱导效应及其分子机制。通过前体饲喂策略，向培养细胞中添加DHAA，利用HPLC和GC-MS检测代谢产物变化，并结合RT-PCR分析关键基因表达水平。结果表明，饲喂25 mg/L DHAA培养2天后，青蒿素产量达到最高值237.5 μg/L。基因表达分析显示，DHAA显著上调青蒿素生物合成途径中三个关键基因的转录水平，其中ADS、CYP71AV1和FPS分别较对照提高3.19倍、7.21倍和2.04倍。此外，研究还分离鉴定了青蒿素及其四个类似物，包括dihydro-epi-deoxyarteannuin B、arteannuin I、arteannuin K和3-β-hydroxy-dihydro-epi-deoxyarteannuin B，表明DHAA在培养细胞中经酶促转化生成青蒿素类产物。但50 mg/L DHAA对细胞表现出明显毒性。该研究首次证实外源DHAA可通过上调FPS、ADS和CYP71AV1基因表达，促进青蒿悬浮细胞中青蒿素及其衍生物的积累，为深入理解青蒿素生物合成调控机制及优化其体外生产提供了重要依据。

创新点

首次报道在青蒿悬浮培养细胞中DHAA经酶促反应转化为青蒿素及其四个类似物；发现DHAA能够显著上调ADS、CYP71AV1和FPS基因的表达。

研究对象（5）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Artemisia annua suspension-cultured cells 青蒿素生物合成途径 FPS 法尼基焦磷酸合酶 催化 催化IPP和DMAPP缩合生成FPP，表达上调2.04倍
Artemisia annua suspension-cultured cells 青蒿素生物合成途径 ADS 紫穗槐-4,11-二烯合酶 催化 催化FPP环化生成紫穗槐-4,11-二烯，表达上调3.19倍
Artemisia annua suspension-cultured cells 青蒿素生物合成途径 CYP71AV1 紫穗槐-4,11-二烯C-12氧化酶（细胞色素P450） 催化 催化紫穗槐-4,11-二烯氧化生成青蒿酸醛中间体，表达上调7.21倍
Artemisia annua suspension-cultured cells 青蒿素生物合成途径 CPR 细胞色素P450还原酶 催化 为CYP71AV1提供电子，表达水平与对照无明显差异
Artemisia annua suspension-cultured cells 甲羟戊酸途径（青蒿素生物合成上游） HMGR 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 催化 催化HMG-CoA生成甲羟戊酸，表达水平与对照无明显差异

关键发现

  1. 饲喂DHAA (25 mg/L) 培养2天后，青蒿素最高产量达237.5 μg/L
  2. RT-PCR结果显示DHAA使ADS、CYP71AV1和FPS基因转录水平分别较对照上调3.19倍、7.21倍和2.04倍
  3. 分离鉴定了青蒿素及四个类似物（dihydro-epi-deoxyarteannuin B, arteannuin I, arteannuin K, 3-β-hydroxy-dihydro-epi-deoxyarteannuin B）
  4. 50 mg/L DHAA对培养细胞表现出明显毒性。

研究结论

DHAA是青蒿素生物合成的关键中间体，在青蒿悬浮培养细胞中通过上调FPS、ADS和CYP71AV1基因表达促进青蒿素及其类似物的合成，该过程涉及酶催化反应。