Substrate cycles in Penicillium chrysogenum quantified by isotopic non-stationary flux analysis
- 作者
- Zheng Zhao, Angela ten Pierick, Lodewijk de Jonge, Joseph J Heijnen, S Aljoscha Wahl
- 单位
- Department of Biotechnology, Delft University of Technology; Kluyver Centre for Genomics of Industrial Fermentation, Delft University of Technology; DSM Biotechnology Center
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2012）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-11-140
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
定量解析产黄青霉中底物循环通量及其ATP消耗，解释代谢通量分析中无法平衡的ATP缺口，并评估其对青霉素生产的影响
研究策略
采用同位素非稳态13C标记实验（1小时wash-in），结合包含3个细胞区室、94个代谢物和177个反应的大规模INST 13C代谢模型，通过拟合标记动态数据估计包括8个底物循环在内的细胞内通量分布
核心内容
该研究利用同位素非稳态13C标记实验（1小时wash-in）结合包含3个细胞区室、94个代谢物和177个反应的大规模代谢模型，系统量化了产黄青霉中8个底物循环的通量。通过拟合标记动态数据，研究者整合胞内和胞外代谢物标记信息，识别出G6P磷酸酶和葡萄糖外排等新代谢活性，并将模型扩展至涵盖储存碳水化合物周转和转运循环。结果显示底物循环总ATP消耗为42.8 mmol/CmolBM/h，占代谢通量分析中ATP平衡缺口的52.1%。各循环通量中，丙酮酸回收和AcCoA回收贡献最大（分别为13.1和11.3 mmol/CmolBM/h），其次为G6P磷酸酶（10.6±2.1）和FBPase（7.25±0.91），后者最大酶活约为估计通量的3倍。模型扩展后拟合残差平方和从12770降至1378.4，显著改善。该工作首次在工业菌株中系统量化底物循环的ATP浪费，为理解储存代谢和转运循环提供了定量基础，并指出剩余ATP缺口可能源于其他未建模的耗能活动，为提高青霉素得率指明了潜在代谢工程靶点。
创新点
首次在工业菌株中系统量化8个底物循环通量；整合胞内和细胞外代谢物标记数据识别新的代谢活性（如G6P磷酸酶和葡萄糖外排）；扩展代谢网络模型纳入储存碳水化合物周转和转运循环；使用短时标记实验（1小时）而非长时间稳态方法
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Penicillium chrysogenum | 全局代谢网络 | — | — | 调控 | 高青霉素G生产菌株DS17690，恒化培养（稀释率0.05 h^-1），碳源为85%葡萄糖和15%乙醇 |
| Penicillium chrysogenum | 糖异生/底物循环 | — | FBPase（果糖-1,6-二磷酸酶） | 催化 | 估计通量7.25±0.91 mmol/CmolBM/h，最大酶活24 mmol/CmolBM/h，占ATP缺口的重要部分 |
| Penicillium chrysogenum | 底物循环 | — | G6P磷酸酶 | 催化 | 将G6P去磷酸化为葡萄糖并导出胞外，通量10.6±2.1 mmol/CmolBM/h，依赖胞外葡萄糖标记数据 |
| Penicillium chrysogenum | 糖原代谢 | — | 糖原磷酸化酶/葡聚糖酶 | 催化 | 多糖降解通量6.47±0.76 mmol/CmolBM/h，糖原池周转，消耗ATP |
| Penicillium chrysogenum | 甘露醇代谢 | — | 甘露醇脱氢酶/甘露醇-1-磷酸脱氢酶 | 催化 | 甘露醇循环通量1.326±0.162 mmol/CmolBM/h，涉及F6P-甘露醇的合成与降解，胞外甘露醇浓度显著 |
| Penicillium chrysogenum | 海藻糖代谢 | Pc16g11870, Pc22g03670 | 海藻糖酶（酸性/中性） | 催化 | 海藻糖循环通量0.065±0.014 mmol/CmolBM/h，胞外海藻糖浓度梯度高，存在转出和胞外降解 |
| Penicillium chrysogenum | 赤藓醇/多元醇代谢 | — | — | 催化 | 赤藓醇循环通量0.021±0.017 mmol/CmolBM/h，多元素循环之一 |
| Penicillium chrysogenum | 丙酮酸线粒体转运 | — | 丙酮酸转运蛋白 | 转运 | 存在未标记的碳流入线粒体丙酮酸池（rz_8a=13.1 mmol/CmolBM/h），推测与缬氨酸/2-甲基柠檬酸循环相关 |
| Penicillium chrysogenum | 乙酰辅酶A代谢 | — | — | 转运 | 未标记碳流入胞质AcCoA池（rz_8d1=11.3 mmol/CmolBM/h），可能来自脂肪酸降解和氨基酸回收 |
| Penicillium chrysogenum | 葡萄糖跨膜转运 | — | 葡萄糖转运蛋白/外排蛋白 | 转运 | 胞内葡萄糖/胞外葡萄糖浓度比151，显示主动摄取（质子同向转运）和G6P磷酸酶相关的外排，消耗ATP |
| Penicillium chrysogenum | 磷酸戊糖途径 | — | 转醛酶 | 催化 | 非氧化PPP中通过转醛酶反应产生C1-C6重排，对m+2分数有贡献，估计通量2.92 mmol/CmolBM/h |
关键发现
底物循环总ATP消耗为42.8 mmol/CmolBM/h，占MFA ATP平衡缺口的52.1%。各循环通量：FBPase 7.25±0.91，G6P磷酸酶10.6±2.1，多糖降解6.47±0.76，甘露醇循环1.326±0.162，海藻糖循环0.065±0.014，赤藓醇循环0.021±0.017，丙酮酸回收13.1，AcCoA回收11.3（单位均为mmol/CmolBM/h）。胞内/胞外浓度比：磷酸化糖类平均51±5，海藻糖401，葡萄糖151，甘露醇121。FBPase最大酶活为24 mmol/CmolBM/h，为估计通量的3倍。模型扩展后拟合残差平方和从12770降至1378.4，F值为51。生物量干重为6.17 g/L。
研究结论
同位素非稳态13C通量分析能够系统量化产黄青霉中的底物循环，这些循环消耗的ATP约占MFA中未知ATP消耗的52.1%，剩余缺口可能来自其他未建模的耗能活动。研究结果为理解储存代谢、转运循环和ATP浪费提供了定量见解，并为提高工业菌株产物得率提供了潜在靶点。