Hydrogen-driven asymmetric reduction of hydroxyacetone to (R)-1,2-propanediol by Ralstonia eutropha transformant expressing alcohol dehydrogenase from Kluyveromyces lactis
- 作者
- Takahiro Oda, Koji Oda, Hiroaki Yamamoto, Akinobu Matsuyama, Masaharu Ishii, Yasuo Igarashi, Hirofumi Nishihara
- 单位
- Department of Bioresource Science, College of Agriculture, Ibaraki University, 3-21-1 Chu-ou, Ami-machi, Inashiki-gun, Ibaraki 300-0393, Japan; Green Product Development Center, R&D Management, Daicel Corporation, 1-1 Shinko-cho, Myoko, Niigata 944-8550, Japan; Department of Biotechnology, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo, 1-1-1 Yayoi, Bunkyo-ku, Tokyo 113-8657, Japan
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2013）
- DOI
- 10.1186/1475-2859-12-2
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
实现以氢气为驱动力、无需外源辅酶添加的体内偶联反应，将羟丙酮不对称还原为(R)-1,2-丙二醇，避免化学计量辅酶使用和副产物污染问题。
研究策略
在氢氧化细菌Ralstonia eutropha H16中，利用氢化酶启动子异源表达来自Kluyveromyces lactis的NAD依赖性醇脱氢酶(KIADH)，与内源NAD还原型可溶性氢化酶(ReSH)偶联，通过氢气驱动辅酶NADH再生，实现全细胞催化不对称还原。
研究路线图
核心内容
本研究构建了以氢气驱动的体内辅酶再生与不对称还原偶联体系，用于将羟丙酮转化为高光学纯度的(R)-1,2-丙二醇。研究在氢氧化细菌Ralstonia eutropha H16中，通过氢化酶启动子异源表达来自Kluyveromyces lactis的NAD依赖性醇脱氢酶（KIADH），并与内源可溶性氢化酶（ReSH）偶联，实现无需外源辅酶添加的全细胞催化。结果表明，重组菌株H16-KLB4中ReSH和KIADH活性分别为3.22 U/ml和4.64 U/ml，体内反应可将2%羟丙酮完全转化（转化率99.1%）。罐式补料分批反应76小时产物浓度达67.7 g/L，平均反应速度0.89 g/L/hr，对映体过量99.8%。值得注意的是，氢分压降至10%时反应速度仍与100%氢相当，且细胞在厌氧条件下可重复使用六批，总产物达189 g/L，但活性逐步下降至首批的39.6%。该策略避免了化学计量辅酶添加和副产物污染，对氢分压要求低，为绿色不对称还原工业应用提供了可行平台。
创新点
['首次报道R. eutropha转化株中由氢气驱动的体内偶联反应（ReSH与异源ADH）', '无需外源添加辅酶，仅依靠细胞内源cofactor', '高浓度底物下反应速度下降程度显著低于体外酶偶联系统', '产物(R)-1,2-丙二醇对映体过量达99.8%', '10%氢分压即可维持与100%氢相当的反应速度，可使用粗氢气', '细胞催化剂可重复使用，多次批次反应仍保持较高活性']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Ralstonia eutropha H16-KLB4 | 氢驱动辅酶再生与不对称还原耦合通路 | KIADH | 醇脱氢酶 (KIADH, from Kluyveromyces lactis) | 催化 | 异源表达，催化羟丙酮不对称还原为(R)-1,2-丙二醇 |
| Ralstonia eutropha H16 | 氢驱动NADH再生 | — | NAD还原型可溶性氢化酶 (ReSH) | 催化 | 内源酶，催化H2氧化并还原NAD+为NADH，为耦合反应提供还原力 |
| Escherichia coli HB101 (pSE-KLB2) | 体外酶偶联（仅用于制备KIADH酶液） | KIADH | 醇脱氢酶 (KIADH) | 催化 | 用于体外偶联实验的酶源 |
关键发现
- 体外偶联反应中，2%羟丙酮条件下20小时生成235–252 μmol 1,2-丙二醇，3%条件下生成134–158 μmol。异源表达后H16-KLB4在FGN培养基中ReSH活性3.22 U/ml、KIADH活性4.64 U/ml，野生型H16仅ReSH活性4.10 U/ml。体内偶联反应中，使用800 μl细胞悬液可将2%羟丙酮完全还原（转化率99.1%）
- 500 μl细胞悬液在2%底物下20小时生成253 μmol（1.72% v/v）产物，3%和5%底物时相对产量分别为88.4%和74.4%。罐式补料分批反应76小时产物浓度达67.7 g/L（6.54% v/v），平均反应速度0.89 g/L/hr，总底物转化率75.6%，产物e.e.为99.8%。氢分压影响实验显示，100% H2时平均反应速度1.84 g/L/hr，30%时1.35 g/L/hr，10%时1.24 g/L/hr
- 反向实验依次为1.21、1.13、1.17 g/L/hr，说明10%氢分压已足够。细胞循环实验中，厌氧操作下六批总产物189 g/L，第六批平均速度为第一批的39.6%
- 空气操作下六批总产物166 g/L，第六批为32.3%。
研究结论
利用R. eutropha转化株表达异源醇脱氢酶，构建的氢驱动体内偶联系统可在无外源辅酶条件下持续进行羟丙酮不对称还原，产物浓度高、光学纯度高，且对氢分压要求低、细胞可重复利用，为绿色工业生物过程提供了有前景的平台。