Regulation of terpenoid biosynthesis by miRNA in Persicaria minor induced by Fusarium oxysporum
- 作者
- Abdul Fatah A. Samad, Reyhaneh Rahnamaie-Tajadod, Muhammad Sajad, Jaeyres Jani, Abdul Munir Abdul Murad, Normah Mohd Noor, Ismanizan Ismail
- 单位
- School of Biosciences and Biotechnology, Faculty of Science and Technology, Universiti Kebangsaan Malaysia; Institute of Systems Biology, Universiti Kebangsaan Malaysia; Borneo Medical and Health Research Centre, Faculty of Medicine and Health Sciences, Universiti Malaysia Sabah; Department of Plant Breeding and Genetics, University College of Agriculture & Environmental Sciences, The Islamia University of Bahawalpur; Department of Biosciences, Faculty of Science, Universiti Teknologi Malaysia
- 杂志
- BMC Genomics（2019）
- DOI
- 10.1186/s12864-019-5954-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
解析尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）诱导下小蓟（Persicaria minor）中miRNA对萜类生物合成的调控机制；此前该植物中miRNA参与萜类调控的作用仍不清楚，需要探索。
研究策略
用尖孢镰刀菌接种小蓟诱导萜类积累；SPME GC-MS进行萜类代谢物谱分析并确定最佳诱导时间点；构建小RNA文库进行高通量测序；鉴定差异表达miRNA和预测新miRNA；利用psRobot预测靶标基因并进行GO功能注释；RT-qPCR验证miRNA及其靶标表达；降解组测序确定miRNA切割位点；Spearman相关分析解析miRNA-代谢物和mRNA-代谢物关系。
核心内容
本研究以尖孢镰刀菌接种小蓟（Persicaria minor）为体系，系统解析了miRNA对萜类生物合成的转录后调控机制。通过SPME GC-MS代谢谱分析发现接种后第6天萜类积累达到峰值，其中α-雪松烯、朱栾倍半萜烯和β-红没药烯显著增加。结合小RNA高通量测序，共鉴定出58个显著差异表达miRNA，分属30个家族，并发现了2个新miRNA（pmi-nov_12和pmi-nov_13）。靶标预测与降解组测序证实，6个miRNA通过靶向MVA途径的MVD、倍半萜合酶、FDS、HMGR、MVK以及MEP途径的DXS、DXR等关键酶基因发挥调控作用，其中pmi-miR396a和pmi-miR6300的切割位点位于miRNA序列第10-11位之间。RT-qPCR验证显示pmi-miR530在9天时急剧上调超过12倍，pmi-miR396a上调2.5倍，HMGR表达同步上调超过3倍。该研究首次报道了尖孢镰刀菌诱导小蓟萜类积累的miRNA调控网络，为利用miRNA作为基因工具定向调控小蓟萜类生物合成提供了理论基础。
创新点
['首次报道尖孢镰刀菌接种可诱导小蓟萜类含量增加', '在小蓟中鉴定出2个新的miRNA（pmi-nov_12和pmi-nov_13）', '系统揭示了6个miRNA通过靶向MVA和MEP途径关键酶基因（MVD、倍半萜合酶、FDS、HMGR、MVK、DXS、DXR、ADH等）对萜类生物合成进行转录后调控', '通过降解组测序验证了pmi-miR396a和pmi-miR6300的切割位点位于miRNA序列第10-11位之间']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Persicaria minor (kesum) | MVA（甲羟戊酸）途径 | HMGR | 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶 | 催化 | pmi-miR6300的靶标；MVA途径限速酶，催化HMG-CoA转化为甲羟戊酸 |
| Persicaria minor (kesum) | MVA（甲羟戊酸）途径 | MVK | 甲羟戊酸激酶 | 催化 | pmi-nov_13的靶标；催化甲羟戊酸转化为甲羟戊酸-5-磷酸 |
| Persicaria minor (kesum) | MVA（甲羟戊酸）途径 | MVD | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶 | 催化 | pmi-miR530的靶标；催化甲羟戊酸二磷酸转化为IPP |
| Persicaria minor (kesum) | MVA（甲羟戊酸）途径 | FDS | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | pmi-miR6173的靶标；参与倍半萜前体FPP合成 |
| Persicaria minor (kesum) | MVA（甲羟戊酸）途径 | sesquiterpene synthase | 倍半萜合酶 | 催化 | pmi-miR6173的靶标；催化倍半萜合成 |
| Persicaria minor (kesum) | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | DXS | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | pmi-miR396a的靶标；MEP途径限速酶，催化丙酮酸与D-甘油醛3-磷酸缩合生成DXP |
| Persicaria minor (kesum) | MEP（甲基赤藓醇磷酸）途径 | DXR | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | pmi-miR398f/g的靶标；催化DXP转化为MEP |
| Persicaria minor (kesum) | 次生代谢物生物合成 | peroxidase57 | 过氧化物酶57 | 催化 | pmi-miR396a的靶标；ROS清除剂，参与胁迫早期信号 |
| Persicaria minor (kesum) | GLV（绿叶挥发物）生物合成 | ADH | 醇脱氢酶 | 催化 | pmi-nov_12的靶标；经氢过氧化物裂解酶途径催化醇与醛之间的转换 |
关键发现
- SPME GC-MS分析显示接种尖孢镰刀菌后第6天（6 dpi）萜类积累最高，其中α-雪松烯（α-cedrene）、朱栾倍半萜（valencene）和β-红没药烯（β-bisabolene）显著增加。共鉴定到58个显著差异表达miRNA（分属30个家族），摘要报告33个上调、25个下调（结果部分为31个上调、27个下调）。小RNA测序C文库和F文库分别获得约12,409,685和42,985,084条原始reads，clean reads分别为7,724,932和25,726,524条
- C文库含111,235（1.44%）条miRNA序列（2,610条唯一reads），F文库含711,498（2.77%）条miRNA序列（6,131条唯一reads）。鉴定出2个新miRNA（pmi-nov_12和pmi-nov_13），RT-PCR验证前体长度分别约80 bp和75 bp。靶标预测发现4个miRNA靶向MVA途径：pmi-miR530靶向MVD、pmi-miR6173靶向倍半萜合酶和FDS、pmi-miR6300靶向HMGR、pmi-nov_13靶向MVK
- 2个miRNA靶向MEP途径：miR396a靶向DXS、miR398f/g靶向DXR
- 新miRNA pmi-nov_12靶向GLV生物合成的ADH。RT-qPCR显示pmi-miR396a在9 dpi上调2.5倍，pmi-miR530在9 dpi急剧上调超过12倍，HMGR在9 dpi上调超过3倍，pmi-nov_12在9 dpi上调1.2倍。降解组测序获得17,532,759条原始reads、15,493,710条clean reads和3,079,840条序列标签，检测到pmi-miR396a和pmi-miR6300的切割位点。
研究结论
6个研究的miRNA在小蓟中通过转录后水平调控萜类生物合成（MVA和MEP途径）。这种miRNA调控行为有望作为基因工具用于小蓟萜类生物合成的调控。