Deregulation of phytoene- \beta - carotene synthase results in derepression of astaxanthin synthesis at high glucose concentration in Phaffia rhodozyma astaxanthin-overproducing strain MK19
- 作者
- Lili Miao, Shuang Chi, Mengru Wu, Zhipei Liu, Ying Li
- 单位
- State Key Laboratory of Microbial Resources, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, No. 1 West Beichen Road, Chaoyang District, Beijing 100101, People's Republic of China; State Key Laboratory of Agrobiotechnology and College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100193, People's Republic of China
- 杂志
- BMC Microbiology（2019）
- DOI
- 10.1186/s12866-019-1507-6
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
高葡萄糖浓度（>100 g/L）对法夫酵母（Phaffia rhodozyma）虾青素合成的强烈抑制作用及其分子机制尚不清楚，严重制约工业化生产。
研究策略
比较野生型菌株JCM9042和葡萄糖代谢去阻遏突变株MK19在40、110和160 g/L葡萄糖浓度下的类胡萝卜素积累和关键基因表达，并通过过表达creA验证其调控作用。
核心内容
本研究通过比较法夫酵母野生型菌株JCM9042与高产虾青素突变株MK19在40、110和160 g/L葡萄糖浓度下的类胡萝卜素积累和相关基因表达，解析了高糖抑制虾青素合成的分子机制。结果显示，野生型在110 g/L葡萄糖下24–72 h的β-胡萝卜素含量仅为40 g/L时的14%–17%，总类胡萝卜素降低2–3倍，而MK19在该浓度下总类胡萝卜素达1231 μg/gDW，虾青素达900 μg/gDW，均高于40 g/L时的水平，且pbs基因表达完全不受葡萄糖抑制，crtE转录水平为野生型的2倍以上。进一步研究发现，葡萄糖信号通路中creA、reg1和hxk2参与调控pbs表达；野生型中creA受葡萄糖强烈诱导，而MK19中维持低水平，过表达creA的MK19转化株总类胡萝卜素下降约50%。这证实MK19的去抑制机制主要通过解除pbs等类胡萝卜素合成基因的碳代谢物阻遏实现。该发现明确了CreA、Reg1和Hxk2介导的葡萄糖信号通路对pbs的调控作用，为通过工程化改造pbs及相关调控基因进一步提升工业化虾青素产量提供了靶点。
创新点
首次在高葡萄糖浓度（110 g/L）下从代谢物和转录水平解析虾青素合成抑制机制；发现双功能酶PBS（八氢番茄红素-β-胡萝卜素合酶）是限速和调控关键靶点；揭示CreA、Reg1和Hxk2在葡萄糖信号通路中介导pbs调控的新机制。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 类胡萝卜素生物合成通路 | crtE | GGPP合成酶（CRTE） | 催化 | 催化FPP→GGPP；在高葡萄糖下表达受抑制，MK19中mRNA水平约为JCM9042的2倍 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 类胡萝卜素生物合成通路 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶（CRTI） | 催化 | 催化八氢番茄红素→番茄红素；高葡萄糖下表达增强，160 g/L时受抑制 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 类胡萝卜素生物合成通路 | pbs | 八氢番茄红素-β-胡萝卜素合酶（PBS） | 催化 | 双功能酶，催化GGPP→八氢番茄红素和番茄红素→β-胡萝卜素；高葡萄糖下表达强烈抑制，110 g/L时降至10%，MK19中完全去抑制 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 类胡萝卜素生物合成通路 | ast | 虾青素合酶（AST） | 催化 | 催化β-胡萝卜素→虾青素；高葡萄糖下表达受抑制，MK19中表达明显升高 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 葡萄糖代谢调控通路 | creA | CreA转录因子 | 调控 | 全局负调控因子，结合靶基因启动子抑制转录；JCM9042中受葡萄糖诱导，MK19中不被诱导 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 葡萄糖代谢调控通路 | reg1 | Reg1蛋白磷酸酶调控亚基 | 调控 | 与Glc7形成磷酸酶复合物，抑制Snf1激酶活性并维持CreA活性；JCM9042中受葡萄糖诱导，MK19中诱导减弱 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 葡萄糖代谢调控通路 | hxk2 | 己糖激酶2（Hxk2） | 调控 | 在葡萄糖信号中维持Mig1/CreA抑制复合物结构；MK19中表达水平很低且不受葡萄糖诱导 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 葡萄糖代谢调控通路 | snf1 | Snf1激酶 | 调控 | 低葡萄糖时激活并磷酸化CreA，使其失活；高葡萄糖时被Glc7-Reg1抑制 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 葡萄糖代谢调控通路 | snf4 | Snf4 | 调控 | Snf1激酶复合物调节亚基 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 葡萄糖代谢调控通路 | sip5 | Sip5 | 调控 | 参与Snf1激酶复合物调控 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 葡萄糖代谢调控通路 | sak1 | Sak1激酶 | 调控 | 促进Snf1活性；在MK19中受葡萄糖诱导表达增强 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 葡萄糖代谢调控通路 | glc7 | Glc7磷酸酶 | 调控 | 与Reg1形成复合物去磷酸化Snf1，抑制其活性 |
| Phaffia rhodozyma JCM9042 | 乙醇代谢通路 | alcA | 醇脱氢酶I（ADH I） | 催化 | 乙醇脱氢酶，作为CreA抑制的对照基因 |
| Phaffia rhodozyma MK19-CreA9 | 类胡萝卜素生物合成通路 | creA | CreA转录因子 | 调控 | 过表达creA的转化株，总类胡萝卜素含量约为MK19的50%，pbs、ast、crtE、crtI和alcA表达均下调 |
关键发现
- 野生型JCM9042在110 g/L葡萄糖下，24-72 h的β-胡萝卜素含量仅为40 g/L时的14%-17%，总类胡萝卜素降低2-3倍
- Y_P/S从0.033 mg/g（40 g/L）降至0.01 mg/g（110 g/L），降幅>60%。突变株MK19在110 g/L葡萄糖下总类胡萝卜素为1231 μg/gDW（40 g/L时为937 μg/gDW），虾青素900 μg/gDW（40 g/L时为790 μg/gDW）
- β-胡萝卜素在110 g/L下比40 g/L高>50倍（120 h）。MK19中pbs完全不受葡萄糖抑制（110 g/L时mRNA水平为40 g/L的10%），而JCM9042的pbs在110 g/L降至10%
- crtE在MK19中的mRNA水平为JCM9042的2倍以上。creA在JCM9042中受葡萄糖强烈诱导（60 min），MK19中维持低水平
- reg1在JCM9042中30 min葡萄糖诱导时mRNA升高约10倍，MK19中仅轻微升高。过表达creA的MK19-CreA9（突变体9）总类胡萝卜素仅为MK19的约50%。在6%装液量下，MK19在110 g/L葡萄糖时Y_X/S为0.382 g/g，Y_P/S为0.32 mg/g，乙醇积累显著降低（96 h为1.317 g/L vs 10%装液量的9.104 g/L）。
研究结论
MK19在高葡萄糖浓度下的虾青素合成去抑制主要通过解除类胡萝卜素合成基因（尤其是pbs）的表达抑制实现，该过程由葡萄糖信号通路中的CreA、Reg1和Hxk2介导；工程化pbs、creA、reg1和hxk2有望进一步提高工业化虾青素产量。