Proteomic analysis of Artemisia annua - towards elucidating the biosynthetic pathways of the antimalarial pro-drug artemisinin
- 作者
- Laura Bryant, Brian Flatley, Chhaya Patole, Geoffrey D. Brown, Rainer Cramer
- 杂志
- BMC Plant Biology（2015）
- DOI
- 10.1186/s12870-015-0565-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
解析黄花蒿（Artemisia annua）腺毛中青蒿素生物合成相关的蛋白质组，尤其是青蒿素生物合成最终阶段（由二氢青蒿酸向青蒿素转化）的酶学机制，并评估不同序列数据库对蛋白质组鉴定的影响。
研究策略
采用基于LC-MS/MS的蛋白质组学方法，利用新发布的York青蒿contig数据库以及其他四类数据库进行比对，对毛状体富集、毛状体耗竭和全叶样品进行蛋白质鉴定；通过emPAI值进行相对定量比较，结合BLASTx功能注释，聚焦青蒿素生物合成相关酶。
核心内容
本研究利用基于LC-MS/MS的蛋白质组学方法，对黄花蒿毛状体富集、毛状体耗竭及全叶样品进行蛋白质鉴定，并系统比较了包括新发布的York青蒿contig数据库在内的五类序列数据库对鉴定结果的影响。采用emPAI值进行相对定量，结合BLASTx功能注释，重点解析青蒿素生物合成相关酶。使用York contig数据库后，毛状体富集样品鉴定到671个蛋白家族，较以往研究提高7-8倍，部分比较达12-14倍，同时将假阳性率控制在较低水平。研究鉴定到包括ADS、DBR2、HMGR、细胞色素P450及2-烯醛还原酶在内的多种青蒿素合成关键酶，尤其发现过氧化物酶1在毛状体富集样品中emPAI比值高达6.42，呈现显著高丰度表达。这一结果提示青蒿素生物合成最后阶段可能存在由过氧化物酶催化的酶促氧化反应，而非此前认为的单纯非酶促体外转化。该工作不仅通过高质量物种特异数据库大幅扩展了黄花蒿毛状体蛋白质组覆盖度，也为完整解析青蒿素生物合成途径、特别是终产物的体内生成机制提供了新的实验依据。
创新点
首次利用经深度拼接的York青蒿contig数据库进行蛋白质组分析，显著提高毛状体蛋白质鉴定数量（较以往研究提高7-8倍，部分比较达12-14倍）；提出过氧化物酶可能作为酶催化剂参与青蒿素生物合成最后阶段的氧化反应，替代已知的非酶促体外转化途径。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（甲羟戊酸途径） | HMGR | HMG-CoA reductase | 催化 | 甲羟戊酸途径关键酶，催化HMG-CoA还原 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（倍半萜合成） | ADS | Amorpha-4,11-diene synthase | 催化 | 催化法尼基焦磷酸环化形成amorphadiene，是青蒿素支路的关键分支点 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（倍半萜氧化） | CYP71AV1 | Amorph-4,11-diene 12-hydroxylase (cytochrome P450) | 催化 | 催化amorphadiene经三步氧化生成青蒿酸 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（二氢青蒿醛生成） | DBR2 | Artemisinic aldehyde delta-11(13) reductase | 催化 | 催化青蒿醛还原为二氢青蒿醛，是青蒿素前体二氢青蒿酸的关键步骤 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（醛氧化） | ALDH1 | Aldehyde dehydrogenase 1 | 催化 | 可能催化二氢青蒿醛氧化为二氢青蒿酸 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（最终氧化阶段） | — | Peroxidase 1 | 催化 | 在毛状体富集样品中高丰度表达（emPAI比值6.42），可能参与青蒿素生物合成最后阶段的酶促氧化 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（醛还原） | — | 2-alkenal reductase (COLNV1) | 催化 | 与DBR2同源，可能同样催化青蒿醛还原 |
| Artemisia annua | 青蒿素生物合成（细胞色素P450氧化） | — | Putative heme-binding cytochrome P450 (Q2EPZ0) | 催化 | 候选的CYP71AV1同工酶，参与青蒿素合成中的氧化步骤 |
关键发现
- 使用York Artemis contig数据库对毛状体富集样品鉴定到671个蛋白家族（毛状体耗竭774个，全叶749个）
- 使用UniProt viridiplantae数据库鉴定到319、417和408个
- 对应FDR分别为1.9%、3.2%、4.7%、6.2%和8.8%。鉴定到多种青蒿素合成相关酶，包括过氧化物酶1（Q84UA9）、DBR2（C5H429）、ADS（Q9AR04）、2-烯醛还原酶（COLNV1）、HMGR（Q9SWQ3）和细胞色素P450（Q2EPZ0）。毛状体富集样品中过氧化物酶1的emPAI比值（富集/耗竭）高达6.42，显示其在毛状体中高丰度表达。技术重复相对标准偏差约为2.5%（毛状体富集样品）和8%（全叶样品）。
研究结论
本研究表明，使用经过充分拼接和物种特异的高质量序列数据库（如York Artemis contig数据库）能大幅提高蛋白质鉴定的真阳性率并降低假阳性率，显著扩展了黄花蒿毛状体蛋白质组数据。毛状体中过氧化物酶的高丰度表达提示青蒿素生物合成最后阶段可能存在酶促氧化反应，为完整解析青蒿素生物合成途径提供了新的实验依据。