高级醇 · 代谢工程文献库

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Genome-wide identification of resistance genes and cellular analysis of key gene knockout strain under 5-hydroxymethylfurfural stress in Saccharomyces cerevisiae

作者
Qian Li, Peng Feng, Hao Tang, Fujia Lu, Borui Mou, Lan Zhao, Nan Li, Yaojun Yang, Chun Fu, Wencong Long, Ximeng Xiao, Chaohao Li, Wei Wu, Gang Wang, Beidong Liu, Tianle Tang, Menggen Ma, Hanyu Wang
单位
College of Life Science, Leshan Normal University; Department of Applied Microbiology, College of Resources, Sichuan Agricultural University; Bamboo Diseases and Pests Control and Resources Development Key Laboratory of Sichuan Province, College of Life Science, Leshan Normal University; Key Laboratory of Land Resources Evaluation and Monitoring in Southwest, Ministry of Education, Sichuan Normal University; Jiangxi Forestry Science and Technology Promotion and Publicity Education Center; Leshan Institute of Product Quality Supervision and Testing; Engineering Research Center of Sichuan Province Higher School of Local Chicken Breeds Industrialization in Southern Sichuan, College of Life Science, Leshan Normal University; Department of Chemistry and Molecular Biology, University of Gothenburg; State Key Laboratory of Subtropical Silviculture, School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University; Key Laboratory of Tropical Transitional Medicine of Ministry of Education, Hainan Medical University
杂志
BMC Microbiology（2023）
DOI
10.1186/s12866-023-03095-2
所属领域
发酵工程
关键词
5-HydroxymethylfurfuralSIW14Saccharomyces cerevisiaeTolerance
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解决的核心问题

在生物乙醇生产中，5-羟甲基糠醛（HMF）作为主要副产物严重抑制微生物发酵，需鉴定酿酒酵母中与HMF耐受性相关的基因，以提升乙醇发酵菌株的耐受性。

研究策略

利用酿酒酵母全基因敲除文库（约4000株）结合合成基因阵列（SGA）工具进行全基因组筛选，通过SGAtools分析菌落生长评分，结合KEGG和GO富集分析确定候选基因，并通过点板验证和亚细胞结构观察（ROS、线粒体、内质网、液泡、染色质）验证关键基因功能。

研究路线图

100%
研究问题：HMF抑制酵母发酵，需鉴定耐受基因
策略：SGA全基因组筛选（约4000个敲除株）
关键改造：60 mM HMF胁迫+菌落评分+富集分析
关键改造：点板验证+亚细胞结构观察（ROS/ER/线粒体/液泡）
结果：筛选出294个HMF耐受相关基因（202敏感/92耐受）
结果：SIW14为关键基因，敲除致ER异常+12.68%、ROS+22.41%
结论：SIW14保护ER结构、清除ROS，为改造目标提供理论指导
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核心内容

该研究利用酿酒酵母全基因敲除文库结合合成基因阵列（SGA）技术，在5-羟甲基糠醛（HMF）胁迫下进行了全基因组规模的耐受基因筛选，并在细胞学水平上验证了关键基因的功能。研究以约4000株敲除菌株为对象，在60 mM HMF条件下通过菌落生长评分鉴定出294个与HMF耐受相关的基因，其中202个敏感基因和92个耐受基因。富集分析显示OCA1和SIW14参与蛋白磷酸化通路，敲除评分分别为-0.31和-0.42。进一步以SIW14敲除株为对象，在60 mM HMF处理3小时后发现，相比野生型BY4741，其异常内质网比例从17.32%升至30%，ROS阳性细胞比例从22.26%增至44.67%，分别增加了12.68和22.41个百分点。结果表明SIW14通过保护内质网结构和清除ROS维持HMF耐受性，该基因的鉴定为改造高耐受工业菌株、提升纤维素乙醇发酵效率提供了明确靶点。

创新点

首次将SGA技术应用于HMF耐受基因的全基因组筛选；鉴定出SIW14作为新的HMF耐受关键基因，并从细胞学水平揭示其通过保护内质网结构和清除ROS发挥作用的机制。

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae BY4741 蛋白磷酸化修饰途径 SIW14 Siw14p 催化 蛋白酪氨酸磷酸酶，参与磷酸肌醇焦磷酸代谢；敲除后HMF耐受性显著下降，导致内质网异常和ROS积累。
Saccharomyces cerevisiae BY4741 蛋白磷酸化修饰途径 OCA1 Oca1p 催化 蛋白酪氨酸磷酸酶，富集于蛋白磷酸化通路；点板验证显示其敲除株与野生型差异不大，不如SIW14显著。
Saccharomyces cerevisiae BY4741 HMF耐受相关全局调控网络 RVS161 Rvs161p 调控 作为敏感基因实例，其敲除株在60 mM HMF下生长显著受抑，评分为-0.93。
Saccharomyces cerevisiae BY4741 HMF耐受相关全局调控网络 PAT1 Pat1p 调控 作为敏感基因实例，其敲除株在60 mM HMF下生长受抑，评分为-0.44。

关键发现

  1. 筛选出294个与HMF耐受相关的基因（202个敏感基因和92个耐受基因）
  2. OCA1和SIW14富集于蛋白磷酸化通路，筛选评分分别为-0.31和-0.42
  3. 在60 mM HMF处理3小时后，SIW14敲除株相比BY4741，异常内质网比例增加12.68个百分点（从17.32%升至30%），ROS阳性细胞比例增加22.41个百分点（从22.26%升至44.67%）
  4. 60 mM HMF被确定为全基因组筛选的最佳浓度。

研究结论

SIW14基因是酿酒酵母HMF耐受的关键基因，其缺失导致内质网结构损伤和ROS积累增加，从而降低HMF耐受性。该发现为改造高耐受性酿酒酵母菌株和提高纤维素乙醇发酵效率提供了理论指导。