Carotenoid biosynthesis is associated with low-temperature adaptation in Rhodosporidium kratochvilovae

作者: Rui Guo, Tao Liu, Caina Guo, Gongshui Chen, Jingdie Fan, Qi Zhang
杂志: BMC Microbiology（2022）
DOI: 10.1186/s12866-022-02728-2
所属领域: 合成生物学
关键词: CRISPR/Cas9 gene-editing systemCarotenoidsLow-temperature adaptationLycopene cyclase/phytoene synthase geneRhodosporidium kratochvilovae
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解决的核心问题

类胡萝卜素生物合成是否参与并促进红冬孢酵母YM25235的低温适应，以及其与细胞内活性氧水平的关系。

研究策略

利用基于内源U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除类胡萝卜素合成关键基因RKCrtYB（双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合成酶），比较野生型与突变株在30°C和15°C下的类胡萝卜素含量、组成、ROS水平及生长速率。

研究路线图

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核心内容

本研究在红冬孢酵母YM25235中建立了基于内源U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统，并敲除类胡萝卜素合成关键基因RKCrtYB，以探究类胡萝卜素合成与低温适应之间的关系。结果显示，15°C低温培养下野生型总类胡萝卜素含量由2.48 mg/g DCW升至3.17 mg/g DCW，β-胡萝卜素和torularhodin含量均显著增加；而突变株在两类温度下含量仅为0.14和0.13 mg/g DCW，主要组分均未检出，证明该基因对类胡萝卜素合成必不可少。低温下突变株ROS水平较野生型升高更为明显（增长43.4%对27.7%），且生长明显受阻，而30°C下两者生长无显著差异。由此确认类胡萝卜素生物合成通过降低低温诱导的氧化胁迫，维持细胞正常生长，是红冬孢酵母低温适应的重要机制。

创新点

首次在R. kratochvilovae YM25235中建立基于内源U6启动子的CRISPR/Cas9基因编辑系统；通过基因敲除直接证实类胡萝卜素生物合成与低温适应相关。

研究对象（2）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
Rhodosporidium kratochvilovae YM25235	类胡萝卜素生物合成	RKCrtYB	双功能番茄红素环化酶/八氢番茄红素合成酶 (CrtYB)	催化	类胡萝卜素合成关键基因，敲除后类胡萝卜素含量显著降低，低温适应能力下降
Rhodosporidium kratochvilovae YM25235	CRISPR/Cas9基因编辑	Cas9	Cas9核酸酶	催化	来自酿脓链球菌，密码子优化并融合NLS和6×His标签，用于靶向敲除RKCrtYB

关键发现

低温（15°C）下YM25235总类胡萝卜素含量从30°C的2.48 mg/g DCW升至3.17 mg/g DCW，其中torularhodin从0.35升至0.54 mg/g DCW，β-胡萝卜素从1.41升至2.03 mg/g DCW
敲除RKCrtYB后，YM25235/RKCrtyBA在30°C和15°C的总类胡萝卜素含量分别仅为0.14和0.13 mg/g DCW，主要组分（torularhodin、torulene、γ-胡萝卜素、β-胡萝卜素）均未检出
15°C下野生型YM25235的ROS水平较30°C升高27.7%，而突变株升高43.4%，且突变株在15°C的ROS水平显著高于野生型
15°C下突变株生长明显弱于野生型，而30°C下两者生长相似
U6a启动子产生的sgRNA水平较U6b高29.75%。

研究结论

类胡萝卜素生物合成与R. kratochvilovae YM25235的低温适应密切相关，通过维持较低的ROS水平和正常的细胞生长，类胡萝卜素合成有助于该菌株抵抗低温胁迫。