Metabolic stimulation-elicited transcriptional responses and biosynthesis of acylated triterpenoids precursors in the medicinal plant Helicteres angustifolia
- 作者
- Yuying Huang, Wenli An, Zerui Yang, Chunzhu Xie, Shanshan Liu, Ting Zhan, Huaigeng Pan, Xiasheng Zheng
- 单位
- 广州中医药大学
- 杂志
- BMC Plant Biology（2022）
- DOI
- 10.1186/s12870-022-03429-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
山芝麻中酰化三萜类化合物（如heliceric acid和helicterilic acid）含量有限且其生物合成途径研究不足，限制了通过遗传工程提高其产量的可能性。
研究策略
采用代谢刺激（甲基茉莉酸甲酯、水杨酸、机械损伤）处理山芝麻，利用Illumina高通量测序进行转录组分析，筛选差异表达基因和候选生物合成基因，并通过酿酒酵母异源表达和GC-MS分析进行功能验证。
核心内容
本研究以药用植物山芝麻为对象，针对酰化三萜类化合物含量低且生物合成途径不清的问题，采用甲基茉莉酸甲酯、水杨酸和机械损伤进行代谢刺激，结合Illumina高通量测序开展转录组分析。共获得121.62 Gb数据，组装出424,824个unigenes（N50为1300 bp），鉴定出22,430个差异表达基因，并发现500 μM MeJA和400 μM SA处理可显著提升总三萜含量。从中筛选出3个氧化鲨烯环化酶、4个细胞色素P450和3个酰基转移酶候选基因。通过在酿酒酵母WAT11中异源表达及GC-MS分析，功能验证HaOSC1为羽扇醇合酶，催化2,3-氧化鲨烯生成羽扇醇；HaCYPi3与来自冬青的IaAS共表达后产生齐墩果酸，证实其为β-香树脂醇氧化酶，且定位于细胞质。该研究首次报道山芝麻转录组数据，阐明羽扇醇和齐墩果酸这两个酰化三萜前体合成的关键酶促步骤，为后续通过遗传工程提升山芝麻中生物活性酰化三萜产量奠定了重要基础。
创新点
首次报道山芝麻的转录组数据；功能验证了HaOSC1为羽扇醇合酶、HaCYPi3为β-香树脂醇氧化酶，分别催化生成羽扇醇和齐墩果酸，揭示了酰化三萜前体生物合成的关键步骤。
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 三萜生物合成途径（甲羟戊酸途径下游） | HaOSC1 | 羽扇醇合酶（oxidosqualene cyclase） | 催化 | 催化2,3-氧化鲨烯环化生成羽扇醇，已通过GC-MS验证 |
| 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 三萜生物合成途径 | HaOSC2 | 推测的β-香树脂醇合酶（oxidosqualene cyclase） | 催化 | 蛋白表达成功（约87 kDa），但未进行产物验证 |
| 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 三萜生物合成途径 | HaOSC3 | 推测的羽扇醇合酶（oxidosqualene cyclase） | 催化 | 未检测到重组蛋白表达 |
| 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 三萜生物合成途径 | HaCYPi1 | CYP716A亚家族细胞色素P450酶 | 催化 | 候选基因，功能未验证 |
| 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 三萜生物合成途径 | HaCYPi2 | CYP716A亚家族细胞色素P450酶 | 催化 | 候选基因，缺少heme结合域，功能未验证 |
| 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 三萜生物合成途径 | HaCYPi3 | β-香树脂醇氧化酶（CYP716A亚家族） | 催化 | 催化β-香树脂醇C-28氧化生成齐墩果酸，已通过共表达验证 |
| 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 三萜生物合成途径 | HaCYPi4 | CYP716A亚家族细胞色素P450酶 | 催化 | 候选基因，功能未验证 |
| 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae WAT11 | 三萜生物合成途径 | IaAS | α/β-香树脂醇合酶 | 催化 | 来自Ilex asprell，与HaCYPi3共表达以提供β-香树脂醇底物 |
| 大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3) | 三萜生物合成途径（下游酰化修饰） | 三个候选酰基转移酶基因（TATs/TBT，BAHD家族） | BAHD酰基转移酶 | 催化 | 成功表达并纯化，但体外酶活检测未获得阳性结果 |
| 拟南芥原生质体 | 亚细胞定位研究 | HaCYPi3 | HaCYPi3-EGFP融合蛋白 | 区室化 | 利用EGFP标记观察亚细胞定位，结果定位于细胞质 |
关键发现
- 获得121.62 Gb转录组数据，组装出424,824个unigenes（N50=1300 bp，平均长度655 bp），其中245,709个（57.84%）获得注释。共鉴定出22,430个差异表达基因，在机械损伤、MeJA和SA处理组中总三萜含量显著升高。最优处理浓度为500 μM MeJA和400 μM SA。筛选出3个OSCs、4个CYP450s和3个酰基转移酶候选基因。HaOSC1（约86 kDa）经酵母表达验证为羽扇醇合酶，催化2,3-氧化鲨烯生成羽扇醇
- HaCYPi3（约54 kDa）与来自Ilex asprell的IaAS共表达后产生齐墩果酸，证明其为β-香树脂醇氧化酶
- HaCYPi3定位于细胞质。
研究结论
本研究首次报道了山芝麻的转录组，筛选并功能鉴定了HaOSC1（羽扇醇合酶）和HaCYPi3（β-香树脂醇氧化酶），成功合成了酰化三萜的重要前体羽扇醇和齐墩果酸，为解析酰化三萜生物合成途径及后续遗传工程改良奠定了基础。