Isoprenoid biosynthesis in dandelion latex is enhanced by the overexpression of three key enzymes involved in the mevalonate pathway
- 作者
- Katharina M. Putter, Nicole van Deenen, Kristina Unland, Dirk Prüfer, Christian Schulze Gronover
- 单位
- Institute of Plant Biology and Biotechnology, Schlossplatz 8, 48143 Muenster, Germany; Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology (IME), Schlossplatz 8, 48143 Muenster, Germany
- 杂志
- BMC Plant Biology（2017）
- DOI
- 10.1186/s12870-017-1036-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
蒲公英乳胶中异戊二烯生物合成的MVA途径上游酶（ATP柠檬酸裂解酶ACL和乙酰乙酰CoA硫解酶AACT）尚未被表征，且HMGR、ACL、AACT三个关键酶协同过表达对异戊二烯终产物积累的影响未知。
研究策略
从Taraxacum brevicorniculatum乳胶中分离ACL和AACT全长cDNA并分析其时空表达谱；在T. brevicorniculatum中分别和共同过表达拟南芥的AtACL(AB)、AtAACT2和Athmgrc1(S408A)（受REF启动子驱动），检测酶活性、异戊二烯终产物含量及角鲨烯积累。
核心内容
该研究以短角蒲公英（Taraxacum brevicorniculatum）为对象，解析并强化其乳胶中甲羟戊酸（MVA）途径的异戊二烯生物合成。研究人员首先从乳胶中分离了乙酰辅酶A裂解酶（ACL）和乙酰乙酰辅酶A硫解酶（AACT）的全长cDNA，确认其编码序列及乳胶优势表达特性。随后，利用橡胶延伸因子启动子驱动，在蒲公英中分别及共同过表达拟南芥来源的AtACL(AB)、AtAACT2和Athmgrc1(S408A)（组成型活性HMGR突变体）。结果表明，单个过表达分别将ACL、AACT和HMGR活性提高至3.3倍、1.4倍和5.1倍；而三者共表达的转基因株系协同增强MVA通量，使角鲨烯在根中积累高达32 mg/g干重，甾醇水平提高4.2~5.2倍，五环三萜提高1.9~2.2倍，cis-1,4-聚异戊二烯提高2.3倍，但2,3-氧化角鲨烯仅提升约1.8倍，提示其为下游瓶颈。该工作首次在蒲公英乳胶中实现三个MVA关键酶的功能性共表达，证明协同上调上游酶可显著驱动异戊二烯终产物积累，为通过代谢工程提升天然橡胶及相关萜类产量提供了可行策略。
创新点
['首次在蒲公英乳胶中成功同时过表达三个功能性转基因（ACL、AACT和HMGR），并证明其协同效应', '鉴定了T. brevicorniculatum乳胶中优势表达的TbACLA1、TbACLB1和TbAACT1基因', '三基因共表达使角鲨烯在根中积累高达32 mg/g干重，达到工业相关水平']
研究对象（7）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taraxacum brevicorniculatum | Mevalonate (MVA) pathway | TbACLA1 | ATP citrate lyase A subunit | 催化 | 乳胶中优势表达的ACLA异构体，为MVA途径提供乙酰-CoA |
| Taraxacum brevicorniculatum | Mevalonate (MVA) pathway | TbACLB1 | ATP citrate lyase B subunit | 催化 | 与TbACLA1形成异源多聚体，乳胶中优势表达 |
| Taraxacum brevicorniculatum | Mevalonate (MVA) pathway | TbAACT1 | Acetoacetyl-CoA thiolase | 催化 | MVA途径第一步，催化两分子乙酰-CoA缩合为乙酰乙酰-CoA |
| Taraxacum brevicorniculatum | Mevalonate (MVA) pathway | AtACL(AB) | Arabidopsis thaliana ATP citrate lyase fusion protein (ACLA-ACLB) | 催化 | 异源过表达增强ACL活性，驱动MVA通量 |
| Taraxacum brevicorniculatum | Mevalonate (MVA) pathway | AtAACT2 | Arabidopsis thaliana acetoacetyl-CoA thiolase 2 | 催化 | 异源过表达增强AACT活性，与MVA途径上游衔接 |
| Taraxacum brevicorniculatum | Mevalonate (MVA) pathway | Athmgrc1(S408A) | Arabidopsis thaliana HMGR1 catalytic domain with S408A mutation | 催化 | 去除磷酸化抑制位点，比野生型催化域活性高2.5倍，为MVA限速酶 |
| Taraxacum brevicorniculatum | Mevalonate (MVA) pathway | pREF promoter (rubber elongation factor promoter) | — | 调控 | 驱动转基因在乳胶中优势表达 |
关键发现
- 分离的TbACLA1 cDNA为1272 bp编码423氨基酸，TbACLB1为1827 bp编码608氨基酸，TbAACT1为1227 bp编码408氨基酸
- TbACLA1、TbACLB1和TbAACT1主要在乳胶中表达。过表达AtACL(AB)使ACL活性提高3.3倍（ACL-1）、3.1倍（ACL-AACT-HMGR-4和ACL-AACT-HMGR-5）
- 过表达AtAACT2使AACT活性提高1.3、1.4、1.3、1.2倍
- 过表达Athmgrc1(S408A)使HMGR活性提高4.0、3.4、5.1、4.6倍。三转基因株系ACL-AACT-HMGR-4和ACL-AACT-HMGR-5的角鲨烯含量达31.8和26.95 mg/g根干重（最高32 mg/g），甾醇（菜油甾醇、豆甾醇、谷甾醇）水平提高4.2、3.3、5.2、5.1倍，五环三萜（蒲公英甾醇、α-香树脂醇、β-香树脂醇、羽扇豆醇）提高1.9-2.2倍，cis-1,4-异戊二烯提高1.4、1.7、2.3倍
- 2,3-氧化角鲨烯仅提高1.7-1.9倍。Athmgrc1(S408A)比野生型催化域活性高2.5倍。
研究结论
在蒲公英乳胶中同时过表达ACL、AACT和HMGR三个关键酶可协同增强MVA通量，导致角鲨烯大量积累（高达32 mg/g根干重）以及甾醇、五环三萜和cis-1,4-异戊二烯含量增加；2,3-氧化角鲨烯合成是下游瓶颈。该策略为通过代谢工程提高蒲公英乳胶中异戊二烯终产物产量提供了基础。