Molecular and biochemical characterization of a novel isoprene synthase from Metrosideros polymorpha
- 作者
- Soo-Jin Yeom, Moonjung Kim, Seong Keun Kim, Dae-Hee Lee, Kil Koang Kwon, Hyewon Lee, Haseong Kim, Dong-Myung Kim, Seung-Goo Lee
- 单位
- Synthetic Biology and Bioengineering Research Center, KRIBB, Daejeon 34141, Republic of Korea; Department of Chemical Engineering and Applied Chemistry, Chungnam National University, Daejeon 34113, Republic of Korea; Department of Biosystems and Bioengineering, KRIBB School of Biotechnology, University of Science and Technology, Daejeon 34113, Republic of Korea
- 杂志
- BMC Plant Biology（2018）
- DOI
- 10.1186/s12870-018-1315-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异戊二烯是重要的平台化学品，传统石油来源存在能耗高和环境问题；虽然植物可大量产生异戊二烯，但直接提取困难。需要开发新的异戊二烯合酶（IspS）用于微生物高效生产生物基异戊二烯。
研究策略
从植物转录组数据中挖掘新的IspS同源基因，从Metrosideros polymorpha中获得MpIspS基因，在大肠杆菌中克隆表达并纯化，研究其生化性质，再结合外源甲羟戊酸（MVA）途径在工程大肠杆菌中实现异戊二烯生产。
核心内容
本研究从植物转录组数据中挖掘并首次从Metrosideros polymorpha中克隆了新型异戊二烯合酶基因MpIspS。该基因全长1683 bp，编码561个氨基酸，纯化后为65 kDa单体。通过在大肠杆菌中异源表达和生化表征，发现MpIspS以Mn²⁺为最适辅因子，与多数已知异戊二烯合酶偏好Mg²⁺不同，其最适pH为6.0、最适温度为50°C，以DMAPP为底物时Km为8.11 mM，kcat为21 min⁻¹。在工程大肠杆菌中将MpIspS与外源甲羟戊酸（MVA）途径共表达，以甘油为碳源并添加IPTG诱导，72小时异戊二烯产量达到23.3 mg/L，而不含MpIspS的对照菌株不产异戊二烯。该研究提供了一种在大肠杆菌中可溶性高表达且具有较高活性的新型异戊二烯合酶，为微生物合成生物基异戊二烯提供了新的酶催化剂资源和代谢工程策略。
创新点
首次从Metrosideros polymorpha中分离鉴定异戊二烯合酶（MpIspS），该酶以Mn2+为最适辅因子（不同于多数已知IspS偏好Mg2+），最适pH为6.0、温度50°C；在大肠杆菌中可溶性高表达，与MVA途径联用时异戊二烯产量达23.3 mg/L。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MpIspS | MpIspS | 催化 | 异戊二烯合酶，催化DMAPP转化为异戊二烯 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MvaE | MvaE | 催化 | 乙酰-CoA乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶（双功能酶） |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MvaS | MvaS | 催化 | 3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA合酶 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MvaK1 | MvaK1 | 催化 | 甲羟戊酸激酶 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MvaK2 | MvaK2 | 催化 | 磷酸甲羟戊酸激酶 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径 | MvaD | MvaD | 催化 | 甲羟戊酸5-二磷酸脱羧酶 |
| Escherichia coli DH5α | 甲羟戊酸（MVA）途径 | Idi | Idi | 催化 | 异戊烯基二磷酸异构酶 |
| Escherichia coli C2566 | 异戊二烯生物合成 | MpIspS | MpIspS | 催化 | 用于重组蛋白表达和纯化的宿主菌株 |
关键发现
- MpIspS基因长1683 bp，编码561个氨基酸，纯化后为65 kDa单体；以DMAPP为底物时Km为8.11 mM，kcat为21 min^-1，kcat/Km为2.59 mM^-1 min^-1；最适pH
- 0，最适温度50°C（摘要中55°C，结果中50°C），5 mM Mn2+时活性最高；在Mn2+存在下相对活性：Zn2+ 91%、Cu2+ 86%、Ni2+ 79%、Co2+ 74%、Mg2+ 53%、Ca2+ 48%、Fe2+ 2%；在大肠杆菌DH5α中与MVA途径共表达，以甘油为碳源，添加IPTG时72小时异戊二烯产量为23.3 mg/L（OD
- 6±0.4），未添加IPTG对照组为0.43 mg/mL（注意原文单位可能是mg/L笔误，但按原文为0.43 mg/mL，实际可能是0.43 mg/L；这里保留原文数值）；不含对照菌株不产异戊二烯。
研究结论
MpIspS是一种新型异戊二烯合酶，可在大肠杆菌中高水平表达并具有较高酶活性，与异源MVA途径联用能有效生产异戊二烯，可作为生物基异戊二烯合成的关键生物催化剂，为工程微生物生产异戊二烯提供新酶资源。