Functional characterization of the cytochrome P450 monooxygenase CYP71AU87 indicates a role in marrubiin biosynthesis in the medicinal plant Marrubium vulgare
- 作者
- Prema S. Karunanithi, Puja Dhanota, J. Bennett Addison, Shen Tong, Oliver Fiehn, Philipp Zerbe
- 单位
- Department of Plant Biology, University of California Davis; Department of Chemistry and Biochemistry, San Diego State University; West Coast Metabolomics Center, University of California-Davis; Biochemistry Department, King Abdulaziz University
- 杂志
- BMC Plant Biology（2019）
- DOI
- 10.1186/s12870-019-1702-5
- 所属领域
- 植物天然产物生物合成
- 关键词
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解决的核心问题
解析药用植物夏至草（Marrubium vulgare）中马鲁比因（marrubiin）生物合成途径中细胞色素P450单加氧酶（CYP71AU87）的功能，为马鲁比因及相关活性二萜的代谢工程生产提供酶学资源。
研究策略
基于夏至草叶片转录组数据库挖掘P450候选基因，结合系统发育分析、组织表达谱分析，并在本氏烟草（Nicotiana benthamiana）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中进行多基因共表达和异源功能表征，通过GC-MS和NMR鉴定产物结构，并利用不同二萜合酶组合测试底物特异性。
核心内容
该研究旨在解析药用植物夏至草中马鲁比因生物合成途径的关键酶功能。研究人员从夏至草叶片转录组中筛选出95个全长P450候选基因，通过系统发育分析和组织表达谱锁定CYP71AU87，并利用本氏烟草和酿酒酵母进行异源共表达以表征其功能。结果表明，CYP71AU87可将二萜合酶产物9,13-epoxy labd-14-ene催化为C-18和C-19位羟基化的两种异构产物，在本氏烟草叶片中积累量达4 μg/g DW；共表达该酶后，底物含量降低3倍，副产物labda-13(16),14-dien-9-ol几乎完全转化。qPCR显示CYP71AU87在叶片和花中的转录丰度分别比MvCPS1和MvELS高3.7倍和5.3倍，且其不转化ent-kaurene等非目标底物。该研究首次明确了CYP71AU87作为C-18/C-19羟基化酶的功能，其与MvCPS1和MvELS协同作用可能参与马鲁比因C-19氧化和内酯环形成的前体生成，为马鲁比因及相关活性二萜的代谢工程提供了新的酶学工具。
创新点
首次鉴定并功能表征了CYP71AU87，证明其催化9,13-epoxy labd-14-ene的C-18/C-19羟基化，生成异构产物9,13-epoxy labd-14-ene-18-ol和9,13-epoxy labd-14-ene-19-ol；同时通过NMR明确了MvELS的次要产物为labda-13(16),14-dien-9-ol；该发现扩展了植物P450在二萜代谢中的功能多样性。
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 马鲁比因生物合成（二萜类） | CYP71AU87 | CYP71AU87 | 催化 | 催化9,13-epoxy labd-14-ene在C-18和C-19位羟基化，生成两个异构产物 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 马鲁比因生物合成（二萜类） | CYP71AU87 | CYP71AU87 | 催化 | 在酵母中与MvCPS1、MvELS和MvCPR共表达也能产生C-18/19羟基化产物 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 马鲁比因生物合成（二萜类） | MvCPS1 | MvCPS1 (peregrinol diphosphate synthase) | 催化 | 催化GGPP转化为peregrinol diphosphate |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 马鲁比因生物合成（二萜类） | MvELS | MvELS (9,13-epoxy-labd-14-ene synthase) | 催化 | 催化peregrinol diphosphate形成9,13-epoxy labd-14-ene，同时产生labda-13(16),14-dien-9-ol等次要产物 |
| 酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae) | 马鲁比因生物合成（二萜类） | MvCPR | MvCPR (细胞色素P450还原酶) | 能量供给 | 为CYP71AU87提供还原当量，支持P450催化 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 二萜类代谢 | Mv1545 | Mv1545 (CYP706家族) | 催化 | 候选P450，未检测到对MvELS产物的催化活性 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 二萜类代谢 | Mv4213 | Mv4213 | 催化 | 候选P450，未检测到对MvELS产物的催化活性 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 二萜类代谢 | Mv6504 | Mv6504 (CYP71家族) | 催化 | 候选P450，未检测到对MvELS产物的催化活性 |
| 本氏烟草 (Nicotiana benthamiana) | 二萜类代谢 | Mv3392 | Mv3392 (CYP71家族) | 催化 | 候选P450，未检测到对MvELS产物的催化活性 |
关键发现
- 从夏至草叶片转录组中鉴定出95个全长P450候选基因
- CYP71AU87与MvCPS1和MvELS共表达时，可将9,13-epoxy labd-14-ene羟基化为两个异构产物（C-18和C-19位），产物在本氏烟草叶片中积累量可达4 μg/g DW
- 共表达CYP71AU87时，9,13-epoxy labd-14-ene含量降低3倍，laba-13(16),14-dien-9-ol几乎完全转化
- qPCR显示CYP71AU87在叶片和花中的转录本丰度分别比MvCPS1和MvELS高3.7倍和5.3倍
- 夏至草中马鲁比因含量可达4 mg/g鲜重
- 底物特异性实验表明CYP71AU87不转化ent-kaurene、manyol oxide或miltiraidiene。
研究结论
CYP71AU87是9,13-epoxy labd-14-ene的C-18/C-19羟基化酶，与二萜合酶MvCPS1和MvELS协同作用，可能参与马鲁比因生物合成中C-19氧化和内酯环形成的前体生成；该研究为马鲁比因及相关生物活性二萜的代谢工程提供了新的酶学工具。