高级醇 · 代谢工程文献库

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Friedelin in Maytenus ilicifolia Is Produced by Friedelin Synthase Isoforms

作者
Thaís B. Alves, Tatiana M. Souza-Moreira, Sandro R. Valentini, Cleslei F. Zanelli, Maysa Furlan
单位
Instituto de Química, Univ. Estadual Paulista-UNESP, Rua Prof. Francisco Degni, 55, Quitandinha, Araraquara, SP 14800-060, Brazil; Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Univ. Estadual Paulista-UNESP, Rod. Araraquara-Jaú km 1, Araraquara, SP 14801-903, Brazil
杂志
Molecules（2018）
DOI
10.3390/molecules23030700
所属领域
合成生物学
关键词
Maytenus ilicifoliaSaccharomyces cerevisiaeheterologous expressionoxidosqualene cyclasepolymorphismtriterpene
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解决的核心问题

鉴定Maytenus ilicifolia叶片中friedelin合酶的新基因异构体，并在酵母中异源表达以验证其功能，为高friedelin产植株的分子标记开发提供基础

研究策略

通过cDNA克隆和测序获得friedelin合酶多个编码序列，分析单核苷酸多态性（SNP）和基因结构，构建系统发育树，并在酿酒酵母VZL1303菌株（ERG7表达水平降低）中异源表达各异构体，通过GC-MS检测和定量friedelin产量

研究路线图

100%
研究问题：鉴定friedelin合酶新基因异构体
策略：cDNA克隆与测序获取多个编码序列
关键改造：分析SNP、基因结构与系统发育树
异源表达：酿酒酵母VZL1303（降低ERG7）
关键改造：4个非同义SNP位于活性位点外
结果：各异构体均产生friedelin（＞50 μg/L）
结果：MiFRS2产量显著低于MiFRS4（p<0.05）
结论：SNP可用作高friedelin产分子标记
前景：酵母异源表达+代谢工程提高产量
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核心内容

该研究克隆并鉴定了Maytenus ilicifolia叶片中friedelin合酶的四个编码序列（MiFRS1-4），在酿酒酵母VZL1303菌株中异源表达以验证其功能。序列分析显示四个异构体核苷酸同源性超过99%，其中MiFRS3与MiFRS4氨基酸序列完全一致，基因结构包含14个内含子和15个外显子，共发现8个SNP，其中4个非同义SNP（Pro39Ser、Glu309Lys、Ile768Lys、Ala48Val）均位于酶活性位点之外。所有异构体在酵母中均能产生friedelin，产量均高于50 μg/L培养物，其中MiFRS2产量显著低于MiFRS4，但各异构体均保留DCTAE等保守活性位点基序。研究表明这些非同义SNP不影响friedelin合成特异性，但可作为种群基因型分析和高产植株筛选的分子标记，同时异源表达系统成功实现了friedelin的微生物生产，为后续通过代谢工程进一步提高产量奠定了基础。

创新点

首次报道M. ilicifolia中friedelin合酶基因的多个等位基因（MiFRS2-4），发现4个非同义SNP位于酶活性位点外，且各异构体在酵母中均能产生friedelin，为利用SNP作为高friedelin产植株的分子标记提供依据

研究对象（4）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Saccharomyces cerevisiae VZL1303 三萜生物合成途径（2,3-氧化鲨烯环化） MiFRS (MiFRS1, MiFRS2, MiFRS3, MiFRS4) Friedelin synthase 催化 催化2,3-氧化鲨烯环化生成friedelin，各异构体均功能表达
Saccharomyces cerevisiae VZL1303 甾醇生物合成途径 ERG7 Lanosterol synthase 催化 竞争同一底物2,3-氧化鲨烯，菌株VZL1303降低了ERG7 mRNA丰度以减少竞争
Maytenus ilicifolia 三萜生物合成途径 MiFRS Friedelin synthase 催化 来自植物叶片的friedelin合酶，存在多个等位基因
Saccharomyces cerevisiae VZL1303 三萜生物合成途径 KdFRS Friedelin synthase (来自Kalanchoe daigremontiana) 催化 作为对比，密码子优化后异源表达

关键发现

  1. 克隆得到4个friedelin合酶编码序列（MiFRS1-4），核苷酸同源性>99%，其中MiFRS3与MiFRS4的氨基酸序列100%一致
  2. 基因含有14个内含子和15个外显子，共发现8个SNP，其中4个非同义SNP（Pro39Ser、Glu309Lys、Ile768Lys、Ala48Val）位于活性位点外
  3. 各异构体在酵母中均产生friedelin，产量均高于50 μg/L培养物，其中MiFRS2产量显著低于MiFRS4（p<0.05），但MiFRS1和KdFRS与其他异构体无显著差异
  4. 所有异构体均保留保守的活性位点基序（如DCTAE和Leu482）

研究结论

M. ilicifolia叶片中存在多个friedelin合酶异构体，这些非同义SNP不影响friedelin合成特异性，但可用于种群基因型分析，作为高friedelin产生材料的分子标记；异源表达friedelin合酶在酵母中实现了friedelin生产，进一步可通过代谢工程提高产量