Functional characterization and comparison of lycopene epsilon-cyclase genes in Nicotiana tabacum
- 作者
- Weina Song, Fang Wei, Shuwen Gao, Chen Dong, Jianfeng Hao, Lifeng Jin, Feng Li, Pan Wei, Jinggong Guo, Ran Wang
- 单位
- College of Life Sciences, Henan Agricultural University; School of Life Sciences, Zhengzhou University; Key Laboratory of Plant Stress Biology, State Key Laboratory of Cotton Biology, School of Life Sciences, Henan University; College of Biological Engineering, Henan University of Technology; Zhengzhou Tobacco Research Institute
- 杂志
- BMC Plant Biology（2022）
- DOI
- 10.1186/s12870-022-03634-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
多倍体烟草中两个高度同源的番茄红素ε-环化酶基因（Nte-LCY1和Nte-LCY2）的功能特性与分化尚不清楚，需要精确解析以指导分子育种。
研究策略
利用CRISPR/Cas9分别敲除Nte-LCY2和Nte-LCY1获得纯合突变体，通过表型观察、类胡萝卜素含量测定、qRT-PCR表达分析、叶绿素荧光参数和ROS含量测定，比较两个基因在类胡萝卜素合成和高光胁迫响应中的功能。
核心内容
该研究利用CRISPR/Cas9技术在多倍体烟草K326中分别敲除两个高度同源的番茄红素ε-环化酶基因Nte-LCY1和Nte-LCY2，系统比较了二者在类胡萝卜素合成与高光胁迫响应中的功能分化。测序结果显示Nte-LCY2编码498个氨基酸，Nte-LCY1编码476个氨基酸，CDS同源性达87.95%。获得的纯合突变体叶片生长更快，总类胡萝卜素和叶绿素含量升高，PSY、PDS、ZDS、CRTISO、β-LCY等类胡萝卜素合成基因表达均上调。值得注意的是，nte-lcy2突变体的β-隐黄质和叶黄素含量分别是nte-lcy1突变体的2.15倍和1.79倍，且高光胁迫下Nte-LCY2表达上调而Nte-LCY1下调。突变体的PSII最大光化学效率（Fv/Fm）和非光化学淬灭（NPQ）高于野生型，活性氧含量显著降低。结果表明Nte-LCY1与Nte-LCY2存在强/弱功能分化，Nte-LCY2是更具价值的育种靶点，其敲除可更有效提升烟草类胡萝卜素含量与高光抗性。
创新点
首次在多倍体烟草中利用CRISPR/Cas9分别敲除两个ε-LCY同源基因，系统揭示了二者存在强/弱功能分化，且表达对高光胁迫响应相反。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | Nte-LCY2 | 番茄红素ε-环化酶 | 催化 | 催化番茄红素一端环化生成δ-胡萝卜素；突变显著增加类胡萝卜素积累 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | Nte-LCY1 | 番茄红素ε-环化酶 | 催化 | 与Nte-LCY2功能相似但效应较弱；高光胁迫下表达下调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | PSY | 八氢番茄红素合酶 | 催化 | 催化GGPP生成八氢番茄红素，突变体中表达上调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | PDS | 八氢番茄红素脱氢酶 | 催化 | 参与八氢番茄红素脱氢，突变体中表达上调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | ZDS | ζ-胡萝卜素脱氢酶 | 催化 | 参与ζ-胡萝卜素脱氢，突变体中表达上调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | CRTISO | 类胡萝卜素异构酶 | 催化 | 催化类胡萝卜素顺反异构，突变体中表达上调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | β-LCY | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 催化番茄红素生成β-胡萝卜素，突变体中表达显著上调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | β-OHase | β-胡萝卜素羟化酶 | 催化 | 催化β-胡萝卜素羟化，突变体中表达上调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | VDE | 紫黄质脱环氧酶 | 催化 | 催化紫黄质脱环氧，正常条件下突变体中表达下调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | ZE | 玉米黄质环氧酶 | 催化 | 催化玉米黄质环氧，突变体中表达显著上调 |
| Nicotiana tabacum K326 | 类胡萝卜素生物合成途径 | NXS | 新黄质合酶 | 催化 | 催化新黄质合成，突变体中表达显著上调 |
关键发现
- Nte-LCY2 CDS长1497 bp编码498个氨基酸，Nte-LCY1长1431 bp编码476个氨基酸，两者CDS同源性87.95%。CRISPR/Cas9突变体（nte-lcy2-1含17-bp替换，nte-lcy2-2含1-bp缺失
- nte-lcy1-1含1-bp缺失，nte-lcy1-2含1-bp插入）叶片生长更快，总类胡萝卜素和叶绿素含量升高，CBP基因（PSY、PDS、ZDS、CRTISO、β-LCY、β-OHase、VDE、ZE、NXS）表达上调。nte-lcy2-1的β-隐黄质和叶黄素含量分别是nte-lcy1-1的2.15倍和1.79倍。高光胁迫下Nte-LCY2表达上调而Nte-LCY1表达下调。突变体PSII最大光化学效率（Fv/Fm）和非光化学淬灭（NPQ）高于野生型，尤其在nte-lcy2-1中
- O2-和H2O2含量显著降低。
研究结论
Nte-LCY1和Nte-LCY2存在强/弱功能分化，Nte-LCY2突变对叶绿素和多种类胡萝卜素含量增加及高光胁迫抗性增强的作用更大，是更具价值的育种靶点。