Iso-Seq analysis of the Taxus cuspidata transcriptome reveals the complexity of Taxol biosynthesis
- 作者
- Xuejun Kuang, Sijie Sun, Jianhe Wei, Ying Li, Chao Sun
- 单位
- Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College
- 杂志
- BMC Plant Biology（2019）
- DOI
- 10.1186/s12870-019-1809-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
紫杉醇生物合成途径尚不完全清楚，导致其供应不足，需要从转录组水平挖掘参与紫杉醇生物合成的候选基因（如CYP450、BAHD酰基转移酶和转录因子），并解析其调控机制。
研究策略
基于PacBio SMRT三代测序和Illumina二代测序，对红豆杉（Taxus cuspidata）转录组进行Iso-Seq分析，经序列校正和去冗余后，利用Cogent和自建流程重建转录本，结合系统发育分析、共表达分析和RT-PCR验证，挖掘紫杉醇生物合成候选基因，并分析可变剪接。
核心内容
该研究利用PacBio SMRT三代测序结合Illumina二代测序，对红豆杉转录组进行了Iso-Seq全长分析，旨在挖掘紫杉醇生物合成的候选基因并解析其调控机制。研究者开发了一套无需参考基因组的转录本校正策略，通过自建流程改进Cogent重建，最终获得148,038个非冗余转录本和58,602个unigenes，BUSCO评估完整度达91.1%。系统发育与共表达分析从139个CYP450和31个BAHD酰基转移酶中筛选出9个CYP450和7个BAHD ACT作为紫杉醇生物合成的领先候选基因，并鉴定6个可能调控该过程的转录因子。关键结果显示，TcuCYP725A21在根中的表达量比叶高47倍以上、比茎高96倍，而DBTNPT在所有组织中表达水平最低，推测其低表达是紫杉醇含量极低的重要原因。共表达分析提示MEP途径是紫杉醇异戊二烯前体的主要来源，并验证了6个基因的组织特异性可变剪接事件，表明转录后调控可能参与紫杉醇合成。该工作为无参考基因组物种的次级代谢基因挖掘提供了实用方法。
创新点
1. 开发了无需参考基因组的全长转录本校正策略，利用自建流程改进Cogent输出，提高了基因家族分析的准确性；2. 结合系统发育和共表达分析，从139个CYP450和31个BAHD ACT中筛选出9个CYP450和7个BAHD ACT作为紫杉醇生物合成的候选基因，并鉴定6个可能调控该过程的转录因子；3. 发现并验证了组织特异性的可变剪接事件。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Taxus cuspidata | 萜类前体生物合成（MEP途径） | DXS, DXR | — | 催化 | 与多数紫杉醇下游基因共表达，提示MEP途径提供异戊二烯前体 |
| Taxus cuspidata | 萜类前体生物合成（MVA途径） | HMGS, HMGR | — | 催化 | 与下游基因表达模式不一致，可能不参与紫杉醇前体供应 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | GGPPS | 香叶基香叶基焦磷酸合酶 | 催化 | 催化DMAPP和IPP缩合生成GGPP |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | TS | 紫杉二烯合酶 | 催化 | 催化GGPP环化形成taxadiene，根中表达量最高 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | T5aH | 紫杉二烯5α-羟化酶 | 催化 | CYP725A亚家族，参与紫杉烷骨架C5位羟基化 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | TAT | 紫杉二烯醇5α-O-乙酰转移酶 | 催化 | BAHD ACT，催化5α-羟基乙酰化，在所有组织中高表达 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | T10βH | 紫杉烷10β-羟化酶 | 催化 | CYP725A亚家族 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | TBT | 紫杉烷2α-O-苯甲酰转移酶 | 催化 | BAHD ACT |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | DBAT | 10-去乙酰巴卡亭III-10-O-乙酰转移酶 | 催化 | BAHD ACT |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | BAPT | 巴卡亭III-13-O-苯基丙酰转移酶 | 催化 | BAHD ACT |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | DBTNBT | 3'-N-去苯甲酰基-2'-脱氧紫杉醇-N-苯甲酰转移酶 | 催化 | 最后一步酶，表达水平最低，限制紫杉醇积累 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | PAM | 苯丙氨酸氨基变位酶 | 催化 | 参与侧链合成，叶中表达最高 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | T2aH, T7βH | 紫杉烷2α-羟化酶、紫杉烷7β-羟化酶 | 催化 | 可交叉利用底物taxusin，形成网状途径 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成 | T13aH | 紫杉烷13α-羟化酶 | 催化 | 表达趋势与TS相反，叶中最高 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成（候选） | TcuCYP725A21, TcuCYP725A9 等9个CYP450 | 细胞色素P450 | 催化 | 候选基因，根中高表达，与已知途径基因共表达 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成（候选） | TcuACT8, 13, 17, 21, 9, 10, 30 等7个BAHD ACT | BAHD酰基转移酶 | 催化 | 候选基因，部分与TAT/TBT表达模式一致，部分与BAPT/DBAT/DBTNBT一致 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成调控 | TcuWRKY45 | WRKY转录因子 | 调控 | 与TcWRKY1同源（88%一致性），根中高表达，可能调控DBAT |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成调控 | TcuBHLH94, TcuBHLH70, TcuBHLH74 | bHLH转录因子 | 调控 | 与TcJAMYC1/2/4同源，可能负调控紫杉醇合成 |
| Taxus cuspidata | 紫杉醇生物合成调控 | TcuERF18, 44, 77, 81, 107 | ERF转录因子 | 调控 | 与TcERF12/TcERF15相近，根中高表达，候选调控基因 |
| Taxus cuspidata | 转录后调控 | TucCYP709K2 (Tuc14855), TucCYP866A22 (Tuc27867) | 细胞色素P450 | 催化 | 可变剪接具有组织偏好性，不同异构体可能功能不同 |
关键发现
- 共获得5,678,524个subreads，平均长度2047 bp；得到568,432个CCS；最终获得148,038个非冗余转录本，经Cogent重建得到58,602个unigenes（13,636个UniTransModels + 44,966个singletons）；BUSCO评估显示91.1%的完整度。
- 鉴定了139个CYP450（36个家族、63个亚家族），其中79个为首次在T. cuspidata中发现；39个BAHD ACT中31个具有完整结构域。
- 共表达分析提示MEP途径是紫杉醇异戊二烯前体的主要来源。
- 发现DBTNPT在所有组织中表达水平最低，推测其表达量低是紫杉醇含量极低的原因之一。
- TcuCYP725A21在根中的表达量比叶高47倍以上、比茎高96倍；TcuCYP725A9在根中的表达量比叶高19倍以上、比茎高60倍。
- 共鉴定1940个转录因子，其中355个C2H2型锌指蛋白，数量显著高于拟南芥和丹参。
- 验证了6个基因的可变剪接事件，并发现部分基因的剪接模式具有组织偏好性。
研究结论
基于PacBio SMRT测序和自建分析流程，成功挖掘了9个CYP450和7个BAHD ACT作为紫杉醇生物合成的领先候选基因，以及6个可能调控该途径的转录因子；共表达分析表明MEP途径为紫杉醇前体合成的主要途径，并发现组织特异性可变剪接可能是紫杉醇生物合成的转录后调控机制。该策略为无参考基因组物种的次级代谢产物生物合成基因挖掘和可变剪接分析提供了实用方法。