沉默lycB基因对雨生红球藻类胡萝卜素合成代谢的影响
- 作者
- 龚文芳, 路立京, 刘鑫, 陈喜文, 陈德富
- 单位
- 南开大学生命科学学院分子遗传学实验室，天津300071
- 杂志
- 植物学报（2013）
- DOI
- 10.3724/sp.j.1005.2013.00233
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
通过沉默lycB基因提高雨生红球藻中番茄红素含量，并探究类胡萝卜素代谢通路的调控机制。
研究策略
构建以杜氏盐藻lycB基因为干扰序列的RNAi载体p1301-BS-RNAi，通过电转化导入雨生红球藻，经抗性筛选、基因组PCR和RT-PCR获得干扰株系，高光诱导后利用HPLC分析类胡萝卜素含量变化。
核心内容
本研究以雨生红球藻为对象，构建以杜氏盐藻lycB基因序列为干扰靶点的RNAi载体p1301-BS-RNAi，通过电转化导入藻细胞，经抗性筛选及基因组PCR和RT-PCR验证，获得16个独立干扰株系。高光诱导后对类胡萝卜素含量进行HPLC分析，结果显示7个株系的番茄红素含量平均增加99.4%，其中株系6-10增幅最高达164.5%；同时β-胡萝卜素含量平均减少48.4%，株系7-10降幅达74.2%。但定量分析表明，番茄红素的增加量仅为β-胡萝卜素减少量的5.0%（范围2.8%~9.8%），意味着约95%被抑制合成所减少的β-胡萝卜素碳流并未流向番茄红素积累，而是被分流至其他代谢产物。该结果证实异源lycB基因的RNAi沉默可有效阻断番茄红素向β-胡萝卜素的转化，但也揭示类胡萝卜素代谢网络具有显著的补偿与分流机制，单一靶点抑制难以实现目标产物的大幅积累，未来需协同调控下游或旁路代谢节点以提升工程效率。
创新点
首次在雨生红球藻中利用异源lycB-RNAi策略研究类胡萝卜素代谢；定量揭示了番茄红素增加量仅为β-胡萝卜素减少量的5%，表明其他代谢通路对碳流的分流作用。
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 雨生红球藻 (Haematococcus pluvialis) H1株 | 类胡萝卜素合成代谢 | lycB | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 内源靶基因，通过RNAi沉默抑制其表达，阻断番茄红素环化成β-胡萝卜素 |
| 杜氏盐藻 (Dunaliella salina) Y6株 | 类胡萝卜素合成代谢 | lycB | 番茄红素β-环化酶 | 催化 | 作为异源RNAi干扰序列的来源，与雨生红球藻lycB同源性达73% |
| 大肠杆菌 (Escherichia coli) DH5α-FT | 载体构建 | atzA | 阿特拉津氯水解酶 | 催化 | 作为筛选标记基因，替代潮霉素抗性基因，使转化株具阿特拉津抗性 |
关键发现
- 获得16个独立干扰株系
- 7个株系高光诱导后，番茄红素含量平均增加99.4%（其中6-10增加164.5%、7-6增加146.7%、7-10增加125.6%、4-2增加124.3%），β-胡萝卜素含量平均减少48.4%（其中7-10减少74.2%、6-10减少68.3%、4-2减少65.5%）
- 番茄红素增加量仅为β-胡萝卜素减少量的5.0%（范围2.8%~9.8%），即减少的β-胡萝卜素中约95%被转化为其他代谢产物。
研究结论
通过异源lycB基因的RNAi沉默可有效抑制雨生红球藻中番茄红素向β-胡萝卜素的转化，使番茄红素积累增加，但由于类胡萝卜素代谢通路的复杂性，需协同调控其他代谢通路才能大幅提高番茄红素含量。