Comprehensive analysis of SPL gene family and miR156a/SPLs in the regulation of terpenoid indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus L
- 作者
- Yaojie Zhang, Xiaofan Ni, Xueqing Fu, Ayat Taheri, Wei Zhang, Pin Liu, Hang Liu, Ling Li, Yuliang Wang, Kexuan Tang
- 杂志
- BMC Plant Biology（2025）
- DOI
- 10.1186/s12870-025-06802-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
长春花中SPL转录因子家族及miR156a/SPL模块对萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成的调控作用尚不清楚，本研究旨在系统鉴定CrSPL基因家族并揭示其与Cro-miR156a在长春碱等TIA合成调控中的功能，为提升TIA产量提供理论依据。
研究策略
全基因组水平鉴定CrSPL基因家族，分析基因结构、系统进化、保守基序、启动子顺式元件、组织表达及MeJA响应；预测miRNA靶点；利用酵母单杂交（Y1H）和双荧光素酶（Dual-LUC）实验验证CrSPL对TIA途径基因启动子的结合与激活；通过瞬时过表达Cro-miR156a和CrSPL2/3/5验证其在体内的调控作用。
核心内容
本研究系统解析了长春花SPL转录因子家族及其与Cro-miR156a在萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成中的调控作用。通过全基因组鉴定获得14个CrSPL基因，分布于6条连锁群，并分析了其结构特征、进化关系、启动子元件及MeJA响应。结合靶点预测、酵母单杂交和双荧光素酶实验，证实Cro-miR156a可靶向抑制CrSPL2/3/4/5/9/12，其中对CrSPL4和CrSPL5的活性抑制分别达55%和69%；子叶瞬时过表达Cro-miR156a使CrSPL2、CrSPL9表达分别下降61.4%和69.7%，同时显著下调CrLAMT、CrSGD、CrTDC等TIA途径基因表达。相反，多个CrSPL成员可直接结合并激活长春碱途径关键酶基因启动子，如CrSPL2/3/4/5/9/12激活CrSGD和CrGS，CrSPL9激活Cr7DLGT和CrLAMT。结果表明Cro-miR156a作为负调控因子、CrSPLs作为正调控因子共同构成TIA合成的精细调控模块，但单独过表达CrSPL2/3/5对途径影响有限，提示需协同因子参与。该研究为阐明长春花TIA调控网络及代谢工程提升长春碱产量提供了理论依据。
创新点
首次系统解析长春花SPL基因家族；证实Cro-miR156a通过靶向CrSPL2/3/4/5/9/12负调控TIA生物合成；发现多个CrSPL成员可直接结合并激活长春碱途径关键酶基因（CrSGD、CrGS、CrLAMT、Cr7DLGT、CrT3R）的启动子。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrSPL2 | CrSPL2 | 调控 | 激活CrSGD/CrGS启动子，直接结合CrLAMT启动子GTAC框 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrSPL3 | CrSPL3 | 调控 | 激活CrSGD/CrGS启动子，结合CrLAMT和CrT3R启动子GTAC框 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrSPL4 | CrSPL4 | 调控 | 激活CrSGD/CrGS启动子，结合CrLAMT启动子GTAC框 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrSPL5 | CrSPL5 | 调控 | 激活CrSGD/CrGS启动子，结合CrLAMT启动子GTAC框 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrSPL7 | CrSPL7 | 调控 | 对CrSGD/CrGS启动子无显著激活，可能不直接参与 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrSPL8 | CrSPL8 | 调控 | 结合CrSGD启动子GTAC框，结合CrLAMT和CrT3R启动子GTAC框 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrSPL9 | CrSPL9 | 调控 | 激活Cr7DLGT、CrLAMT、CrSGD、CrGS、CrT3R启动子，结合CrLAMT启动子GTAC框 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成 | CrSPL12 | CrSPL12 | 调控 | 激活CrSGD/CrGS启动子，结合CrSGD启动子GTAC框 |
| Catharanthus roseus | 萜类吲哚生物碱（TIA）生物合成调控 | Cro-miR156a | miR156a | 调控 | 靶向CrSPL2/3/4/5/9/12，负调控TIA途径基因表达 |
| Catharanthus roseus | 长春碱生物合成（TIA途径） | CrSGD | strictosidine β-D-glucosidase | 催化 | 启动子被CrSPL2/3/4/5/9/12激活 |
| Catharanthus roseus | 长春碱生物合成（TIA途径） | CrGS | geissoschizine synthase | 催化 | 启动子被CrSPL2/3/4/5/9/12激活 |
| Catharanthus roseus | 长春碱生物合成（TIA途径） | Cr7DLGT | 7-deoxygloanetic acid glucosyl transferase | 催化 | 启动子被CrSPL9激活 |
| Catharanthus roseus | 长春碱生物合成（TIA途径） | CrLAMT | loganic acid O-methyltransferase | 催化 | 启动子被CrSPL9激活，并被CrSPL2/3/4/5/8/9直接结合 |
| Catharanthus roseus | 长春碱生物合成（TIA途径） | CrT3R | tabersonine 3-reductase | 催化 | 启动子被CrSPL2/9激活，并被CrSPL3/8直接结合 |
关键发现
- 鉴定出14个CrSPL基因，分布于6条连锁群
- Cro-miR156a在双荧光素酶试验中使CrSPL2、CrSPL3、CrSPL4、CrSPL5活性分别降低约38%、55%、44%、69%
- 在长春花子叶中瞬时过表达Cro-miR156a使CrSPL2、CrSPL3、CrSPL5、CrSPL9表达分别下降61.4%、21%、59%、69.7%，并显著降低CrLAMT、CrSLS、CrTDC、CrSGD、CrRedox1、CrDAT、CrPRX1等TIA途径基因表达
- Y1H显示CrSPL8/12结合CrSGD启动子第二个GTAC框，CrSPL2/3/4/5/8/9结合CrLAMT启动子第三个GTAC框，CrSPL3/8结合CrT3R启动子GTAC框
- Dual-LUC显示CrSPL2/3/4/5/9/12激活CrSGD和CrGS启动子，CrSPL9激活Cr7DLGT和CrLAMT，CrSPL2/9激活CrT3R。
研究结论
Cro-miR156a通过靶向抑制CrSPLs并可能直接作用于TIA途径基因，作为负调控因子抑制长春碱合成；CrSPLs（如CrSPL2/3/4/5/9/12）作为正调控因子直接激活部分TIA途径基因启动子，但单独过表达CrSPL2/3/5对TIA途径影响有限，提示需要其他协同因子。本研究为深入理解长春花TIA调控网络提供了新见解。