Controlling heterologous gene expression in yeast cell factories on different carbon substrates and across the diauxic shift: a comparison of yeast promoter activities
- 作者
- Bingyin Peng, Thomas C Williams, Matthew Henry, Lars K Nielsen, Claudia E Vickers
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0278-5
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在酵母细胞工厂中，不同碳源（葡萄糖、蔗糖、半乳糖、乙醇）和葡萄糖分批培养的二次生长转变（diauxic shift）期间，常用启动子的活性未被充分表征，导致基因表达难以预测和控制，影响工业化应用中的产量、速率和效价。
研究策略
以酿酒酵母为底盘，采用绿色荧光蛋白（GFP）及不稳定型GFP作为报告基因，在单细胞水平通过流式细胞仪系统表征一系列组成型和诱导型启动子在不同碳源及葡萄糖分批培养全过程的活性。
核心内容
该研究以酿酒酵母CEN.PK113-5D为底盘，利用绿色荧光蛋白及其不稳定变体作为报告基因，在单细胞水平上通过流式细胞术系统比较了多种常用组成型和诱导型启动子在葡萄糖、蔗糖、半乳糖和乙醇四种碳源以及葡萄糖分批培养全过程中的活性。结果显示，TDH3、ENO2和ADH1启动子在20 g/L葡萄糖的中期对数期活性最强；PGK1和TDH3在蔗糖上的活性比葡萄糖分别降低37%和32%；在乙醇碳源上，TDH3和PGK1的活性较葡萄糖降低约85%，而SSA1启动子的活性反而比在20 g/L葡萄糖上高约5倍。在葡萄糖分批培养中，组成型启动子如TEF1、TDH3和PGK1在葡萄糖耗尽后活性急剧下降并在乙醇呼吸阶段维持低水平，而SSA1和HXT7启动子在二次生长转变后上调，其中SSA1的表达高于常用TEF1启动子。ADH2启动子在葡萄糖-乙醇分批培养中的去抑制不充分，活性比以乙醇为唯一碳源时低约30倍。CUP1启动子经300 μM铜诱导后的最大表达强度介于TDH3和TEF1之间，且在二次生长转变后仍可被诱导高表达。这些数据系统揭示了碳源种类和二次生长转变对启动子性能的显著影响，为酵母细胞工厂中基因表达模式的预测和启动子选择提供了定量依据。
创新点
首次系统比较了多种常见启动子在四种工业相关碳源上的活性；揭示了组成型启动子在葡萄糖耗尽后及二次生长转变期间表达急剧下降的现象；发现SSA1启动子在二次生长后表达高于常用TEF1启动子；表征了CUP1启动子在铜诱导下的动态表达及其潜力。
研究对象（21）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 糖酵解 | PGK1 | 3-磷酸甘油酸激酶 | 调控 | PGK1启动子（P_PGK1），组成型强启动子，葡萄糖上高表达，乙醇上显著降低 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 糖酵解 | TDH3 | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 调控 | TDH3启动子（P_TDH3），葡萄糖指数期最强启动子之一，乙醇上活性降低约85% |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 糖酵解 | ENO2 | 烯醇化酶 | 调控 | ENO2启动子（P_ENO2），葡萄糖指数期较强启动子 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 糖酵解/乙醇发酵 | ADH1 | 醇脱氢酶 | 调控 | ADH1启动子（P_ADH1），葡萄糖指数期较强启动子 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 糖酵解 | TPI1 | 磷酸丙糖异构酶 | 调控 | TPI1启动子（P_TPI1），组成型启动子 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 翻译延伸 | TEF1 | 翻译延伸因子EF-1α | 调控 | TEF1启动子（P_TEF1），常用组成型启动子，葡萄糖上高表达，二次生长转变后下降 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 翻译延伸 | TEF2 | 翻译延伸因子EF-1α | 调控 | TEF2启动子（P_TEF2），与TEF1类似 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 翻译延伸 | YEF3 | 翻译延伸因子3 | 调控 | YEF3启动子（P_YEF3），组成型启动子 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 半乳糖代谢 | GAL1 | 半乳糖激酶 | 调控 | GAL1启动子（P_GAL1），半乳糖诱导型启动子，在半乳糖上活性最高 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 核糖体生物合成 | RPL3 | 核糖体蛋白L3 | 调控 | RPL3启动子（P_RPL3），核糖体蛋白启动子，葡萄糖上高表达，二次生长转变后下降 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 核糖体生物合成 | RPL15A | 核糖体蛋白L15A | 调控 | RPL15A启动子（P_RPL15A） |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 核糖体生物合成 | RPL4 | 核糖体蛋白L4 | 调控 | RPL4启动子（P_RPL4） |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 核糖体生物合成 | RPL8B | 核糖体蛋白L8B | 调控 | RPL8B启动子（P_RPL8B） |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 热激响应 | SSA1 | 热激蛋白70家族成员 | 调控 | SSA1启动子（P_SSA1），乙醇上活性比葡萄糖高约5倍，二次生长后表达上升 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 热激响应 | SSB1 | 热激蛋白70家族成员 | 调控 | SSB1启动子（P_SSB1） |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 铜离子响应 | CUP1 | 金属硫蛋白 | 调控 | CUP1启动子（P_CUP1），铜诱导型，300 μM铜诱导下表达高于TEF1但低于TDH3 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 海藻糖代谢 | TPS1 | 海藻糖-6-磷酸合酶 | 调控 | TPS1启动子（P_TPS1），低葡萄糖诱导型，活性较弱 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 葡萄糖转运 | HXT7 | 高亲和力葡萄糖转运蛋白 | 调控 | HXT7启动子（P_HXT7），低葡萄糖诱导型，二次生长转变后上调 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 乙醇代谢 | ADH2 | 醇脱氢酶2 | 调控 | ADH2启动子（P_ADH2），乙醇诱导型，但在葡萄糖-乙醇分批培养中未充分去抑制，活性比乙醇培养低约30倍 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 呼吸链/电子传递 | CYC1 | 细胞色素c | 调控 | CYC1启动子（P_CYC1），低葡萄糖诱导型，活性较弱 |
| Saccharomyces cerevisiae CEN.PK113-5D | 丙酮酸代谢 | PDA1 | 丙酮酸脱氢酶E1α亚基 | 调控 | PDA1启动子（P_PDA1），组成型表达，但活性相对较低 |
关键发现
- 在20 g/L葡萄糖中，TDH3、ENO2和ADH1启动子是中期对数期最强的启动子
- PGK1和TDH3启动子在蔗糖上的活性比葡萄糖分别降低37%和32%
- 在乙醇碳源上，TDH3和PGK1启动子活性比葡萄糖降低约85%，比半乳糖降低约60%
- SSA1启动子在乙醇上的活性比在20 g/L葡萄糖上高约5倍
- 在葡萄糖分批培养中，组成型启动子（TEF1、TEF2、TDH3、PGK1、RPL3）在葡萄糖耗尽后活性急剧下降，并在乙醇呼吸阶段保持低水平
- SSA1和HXT7启动子在二次生长转变后上调，SSA1在后二次生长阶段的表达高于常用TEF1启动子
- ADH2启动子在葡萄糖-乙醇分批培养中未充分去抑制，其活性比以乙醇为碳源的培养低约30倍（相对荧光约100 vs 3000）
- CUP1启动子在300 μM铜诱导下，最大表达强度低于TDH3启动子但高于TEF1启动子，且二次生长转变后仍可诱导高表达。
研究结论
不同碳源和二次生长转变显著影响启动子驱动的基因表达，研究提供了多种启动子在不同碳源和分批发酵过程中的性能数据，为酵母细胞工厂中基因表达模式的预测和优化设计奠定了基础，有助于改善产量、速率和效价。