Biosynthesis of β-carotene in engineered E. coli using the MEP and MVA pathways
- 作者
- Jianming Yang, Lizhong Guo
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2014）
- DOI
- 10.1186/s12934-014-0160-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
提高β-胡萝卜素在微生物中的产量，通过增强异戊烯基焦磷酸（IPP）和香叶基二磷酸（GPP）前体供应，并优化发酵工艺，以满足工业化需求。
研究策略
在E. coli BL21(DE3)中共同表达来自枯草芽孢杆菌的DXS和FNI（II型IPP异构酶）以优化MEP途径，引入来自冷杉的GPPS2增强GPP供应，并引入杂合MVA途径与优化MEP途径共表达，结合发酵条件优化。
核心内容
本研究在E. coli BL21(DE3)中系统改造类异戊二烯前体供应途径以提高β-胡萝卜素产量。作者首先在天然MEP途径中分别过表达来自枯草芽孢杆菌的DXS和II型IPP异构酶FNI，使摇瓶产量从对照菌株的1.08 mg/L逐步提升至5.2 mg/L；在此基础上引入冷杉来源的GPPS2以增强GPP供应，产量进一步升至15.2 mg/L，显著优于使用内源IspA的菌株。随后将优化的MEP途径与杂合MVA途径共表达，并通过低拷贝质粒平衡MVA上游模块，最终菌株YJM49摇瓶产量达122.4 mg/L，较仅含天然MEP途径的对照提高约113倍。通过优化甘油浓度、氮源、IPTG和温度等培养条件，摇瓶产量进一步提升至256.8 mg/L。在补料分批发酵中，诱导52小时后β-胡萝卜素产量达到3.2 g/L，甘油转化效率为2.76%。该研究证明了将优化的MEP途径与杂合MVA途径理性组合可显著突破前体供应瓶颈，为利用廉价碳源工业化生产萜类化合物提供了高效策略。
创新点
使用枯草芽孢杆菌的DXS和FNI（II型IPP异构酶）增强前体供应；使用冷杉的GPPS2提高GPP浓度；首次将优化的MEP途径与杂合MVA途径组合在E. coli中高效生产β-胡萝卜素；补料分批发酵产量达到3.2 g/L。
研究对象（14）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| E. coli BL21(DE3) | MEP途径 | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶（DXS） | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌，过表达以增强IPP和DMAPP供应 |
| E. coli BL21(DE3) | MEP途径 | fni | 异戊烯基二磷酸异构酶（FNI，II型） | 催化 | 来自枯草芽孢杆菌，催化IPP与DMAPP互变，提高前体浓度 |
| E. coli BL21(DE3) | 类异戊二烯前体合成 | GPPS2 | 香叶基二磷酸合酶（GPPS2） | 催化 | 来自冷杉，催化DMAPP和IPP缩合生成GPP，比大肠杆菌IspA更高效 |
| E. coli BL21(DE3) | 类异戊二烯前体合成 | ispA | 香叶基/法尼基二磷酸合酶（IspA） | 催化 | 来自大肠杆菌，与GPPS2对比，效果较差 |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（上游） | mvaE | 乙酰辅酶A乙酰转移酶/HMG-CoA还原酶（MvaE） | 催化 | 来自粪肠球菌，催化乙酰-CoA生成甲羟戊酸途径的中间产物 |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（上游） | mvaS | HMG-CoA合酶（MvaS） | 催化 | 来自粪肠球菌，催化乙酰乙酰-CoA与乙酰-CoA缩合生成HMG-CoA |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（下游） | ERG12 | 甲羟戊酸激酶（Erg12） | 催化 | 来自酿酒酵母，催化甲羟戊酸磷酸化 |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（下游） | ERG8 | 磷酸甲羟戊酸激酶（Erg8） | 催化 | 来自酿酒酵母，催化磷酸甲羟戊酸磷酸化 |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（下游） | ERG19 | 二磷酸甲羟戊酸脱羧酶（Erg19） | 催化 | 来自酿酒酵母，催化二磷酸甲羟戊酸脱羧生成IPP |
| E. coli BL21(DE3) | MVA途径（下游） | IDI1 | 异戊烯基二磷酸异构酶（Idi1） | 催化 | 来自酿酒酵母，催化IPP与DMAPP互变 |
| E. coli BL21(DE3) | β-胡萝卜素合成途径 | crtE | GGPP合酶（CrtE） | 催化 | 来自草生欧文氏菌，催化FPP延长为GGPP |
| E. coli BL21(DE3) | β-胡萝卜素合成途径 | crtB | 八氢番茄红素合酶（CrtB） | 催化 | 来自草生欧文氏菌，催化两分子GGPP缩合生成八氢番茄红素 |
| E. coli BL21(DE3) | β-胡萝卜素合成途径 | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） | 催化 | 来自草生欧文氏菌，催化八氢番茄红素脱氢生成番茄红素 |
| E. coli BL21(DE3) | β-胡萝卜素合成途径 | crtY | 番茄红素环化酶（CrtY） | 催化 | 来自草生欧文氏菌，催化番茄红素两端环化生成β-胡萝卜素 |
关键发现
- 最终菌株YJM49在摇瓶中β-胡萝卜素产量为122.4±6.2 mg/L，是仅含天然MEP途径的YJM39（1.08±0.07 mg/L）的约113倍，是含MVA途径和天然MEP途径的YJM45（71.4±4.3 mg/L）的1.7倍。单独过表达DXS使YJM40产量达2.24±0.1 mg/L，为YJM39的约2倍
- 额外表达FNI后YJM41产量达5.2±0.2 mg/L。使用GPPS2的YJM43产量为15.2±0.4 mg/L，高于使用IspA的YJM42（7.86±0.2 mg/L）。含杂合MVA途径的YJM44产量为52.6±1.5 mg/L，约为YJM39的49倍、YJM43的3.5倍。低拷贝质粒表达MVA上游途径的YJM45产量71.4±4.3 mg/L，比高拷贝的YJM44高1.36倍。优化培养条件（20 g/L甘油、10 g/L牛肉粉、0.05 mM IPTG、34°C）后产量提高至256.8±10.4 mg/L。补料分批发酵中，诱导52小时后β-胡萝卜素产量达3.2 g/L，体积生产率为0.37 mg/(L·h·OD600)，甘油转化效率为2.76%。
研究结论
通过将优化的MEP途径（枯草芽孢杆菌DXS和FNI）、冷杉GPPS2和杂合MVA途径共同引入E. coli BL21(DE3)，结合发酵优化，成功构建了高产β-胡萝卜素的菌株YJM49，在补料分批发酵中产量达3.2 g/L，为目前利用廉价碳源生产β-胡萝卜素的最高报道水平。