Microbial host selection affects intracellular localization and activity of alcohol-O-acetyltransferase
- 作者
- Jie Zhu, Jyun-Liang Lin, Leidy Palomec, Ian Wheeldon
- 单位
- Department of Biochemistry, University of California, Riverside, USA, 92521; Department of Chemical and Environmental Engineering, University of California, Riverside, USA, 92521
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2015）
- DOI
- 10.1186/s12934-015-0221-9
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
微生物宿主选择如何影响醇-O-乙酰转移酶(AATase)的胞内定位和酶活，特别是异源表达于大肠杆菌时形成的聚集体导致活性显著降低的问题。
研究策略
比较六种AATase在酿酒酵母和大肠杆菌中的表达水平、胞内定位和酶活；通过调节IPTG浓度控制表达水平，研究聚集体大小与比活性的关系，并用发酵实验验证。
核心内容
该研究系统比较了六种来源的醇-O-乙酰转移酶（AATase）在酿酒酵母和大肠杆菌两种微生物宿主中的异源表达，以探究宿主选择对该酶胞内定位与酶活的影响。结果显示，在酿酒酵母中，Atf1-S.c、Atf2-S.c和Atf-S.p定位于脂滴，而Atf-K.l、Atf-P.a和Atf-S.l分布于胞质；所有AATase在大肠杆菌中均形成聚集体，表达量虽比酿酒酵母高100倍以上，比活性却显著降低，如Atf1-S.c在酿酒酵母和大肠杆菌中的全细胞裂解液活性分别为58±8和11.6±0.1 nmol/min/mg。进一步通过调节IPTG浓度控制表达水平发现，降低表达可减小聚集体尺寸并提高比活性，大肠杆菌中Atf1-S.c在1、10、100 μM IPTG诱导下聚集体面积从0.11±0.05增至0.44±0.20 μm²，比活性分别降低72.6%和84.2%，但24小时发酵中乙酸乙酯产量从1.35±0.10增至6.74±0.24 mg/L。这些结果表明AATase活性不严格依赖膜定位，微生物宿主选择对乙酸乙酯合成至关重要，聚集体虽具活性但效率远低于天然宿主，调节表达水平可部分恢复活性。
创新点
系统对比多种来源AATase在两种微生物宿主中的定位和活性；发现所有AATase在大肠杆菌中均形成具有酶活性的聚集体；证明AATase活性不严格依赖膜定位。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF1 | Atf1-S.c | 催化 | 在酿酒酵母中定位于脂滴；在大肠杆菌中形成聚集体。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF1 | Atf1-S.c | 催化 | 在大肠杆菌中形成有活性的聚集体，无膜定位。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF2 | Atf2-S.c | 催化 | 在酿酒酵母中定位于脂滴；在大肠杆菌中形成聚集体。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF2 | Atf2-S.c | 催化 | 在大肠杆菌中形成聚集体，活性较低。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF1 (S. pastorianus) | Atf-S.p | 催化 | 在酿酒酵母中定位于脂滴；在大肠杆菌中形成聚集体。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF1 (S. pastorianus) | Atf-S.p | 催化 | 在大肠杆菌中形成聚集体，活性较低。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF (K. lactis) | Atf-K.l | 催化 | 在酿酒酵母中呈可溶性分布；在大肠杆菌中形成聚集体。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF (K. lactis) | Atf-K.l | 催化 | 在大肠杆菌中形成聚集体，活性极低。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF (P. anomala) | Atf-P.a | 催化 | 在酿酒酵母中呈点状分布；在大肠杆菌中形成聚集体。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF (P. anomala) | Atf-P.a | 催化 | 在大肠杆菌中形成聚集体，活性极低。 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF (S. lycopersicum) | Atf-S.l | 催化 | 在酿酒酵母中均匀分布于胞质；在大肠杆菌中形成聚集体。 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 酯生物合成（乙醇+乙酰-CoA→乙酸乙酯） | ATF (S. lycopersicum) | Atf-S.l | 催化 | 在大肠杆菌中形成聚集体，活性显著低于酿酒酵母。 |
关键发现
- 在酿酒酵母中，Atf1-S.c、Atf2-S.c和Atf-S.p定位于脂滴，Atf-K.l、Atf-P.a和Atf-S.l分布在胞质
- 所有AATase在大肠杆菌中均形成聚集体，表达量比酿酒酵母高100倍以上，但比活性显著降低。Atf1-S.c在酿酒酵母和E.coli中的全细胞裂解液活性分别为58±8和11.6±0.1 nmol/min/mg
- Atf-S.l分别为21±3和0.5±0.2 nmol/min/mg。降低表达水平可减小聚集体尺寸并提高比活性，例如E.coli中Atf1-S.c在1/10/100 μM IPTG诱导下聚集体面积从0.11±0.05增至0.19±0.08和0.44±0.20 μm²，比活性分别降低72.6±13.1%和84.2±2.7%
- 24小时发酵中乙酸乙酯产量从1.35±0.10增加到4.78±0.28和6.74±0.24 mg/L。
研究结论
微生物宿主选择对AATase介导的乙酸乙酯合成至关重要。大肠杆菌中异源表达导致AATase形成有活性的聚集体并丧失膜定位，比活性较酿酒酵母显著降低；降低表达水平可部分恢复活性。AATase活性不严格依赖膜定位。