Mechanistic investigations on six bacterial terpene cyclases
- 作者
- Patrick Rabe, Thomas Schmitz, Jeroen S. Dickschat
- 单位
- Kekulé-Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, University of Bonn, Gerhard-Domagk-Straße 1, 53121 Bonn, Germany
- 杂志
- Beilstein Journal of Organic Chemistry（2016）
- DOI
- 10.3762/bjoc.12.173
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
六种细菌萜烯环化酶的产物结构不明，环化机理不清，特别是FPP末端甲基的立体化学命运未知。
研究策略
通过基因克隆、异源表达和亲和纯化获得六个重组萜烯环化酶，体外以FPP为底物制备产物，综合运用一维/二维NMR、旋光测定确定产物结构和绝对构型；利用(6-13C)FPP和(13-13C)FPP标记底物结合D2O孵育实验，通过NMR追踪环化机理和立体化学。
核心内容
本研究对六种来源不同的细菌萜烯环化酶进行了系统的机理表征。通过基因克隆、异源表达和亲和纯化获得重组酶后，以法尼基焦磷酸（FPP）为底物体外制备产物，综合运用一维/二维NMR和旋光测定确定了全部产物的化学结构与绝对构型，其中多种倍半萜的NMR数据为首次完整报道。借助(6-13C)FPP标记底物在D2O中孵育，产物C-6位出现氘代所致的13C三重峰（1JCD=19.4 Hz），证明7-epi-α-eudesmol的生物合成经由hedycaryol中间体再质子化完成；同时使用(13-13C)FPP孵育发现标记在各产物中的特征化学位移（15.3–28.6 ppm），揭示六种酶在环化过程中均严格区分FPP末端E/Z甲基。研究还发现细菌来源的倍半萜多数为植物对应产物的对映异构体，这可能构成互不干扰的化学通讯渠道。这些结果完整阐明了六种环化酶的产物结构和立体化学控制机制，为理解细菌与植物萜烯代谢的差异提供了分子依据。
创新点
首次完整报道多个倍半萜的NMR数据；确定了四种产物的绝对构型；证明7-epi-α-eudesmol生物合成经hedycaryol中间体再质子化；揭示六种酶在FPP环化中均严格区分末端E/Z甲基。
研究对象（6）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Streptomyces viridochromogenes DSM 40736 | 倍半萜生物合成 | WP_039931950 | (-)-α-amorphene synthase | 催化 | 异源表达于E. coli BL21，催化FPP生成(-)-α-amorphene |
| Roseiflexus castenholzii DSM 13941 | 倍半萜生物合成 | WP_012119179 | (+)-T-muurolol synthase | 催化 | 异源表达于E. coli BL21，催化FPP生成(+)-T-muurolol及少量α-muurolone和δ-cadinene |
| Streptosporangium roseum DSM 43021 | 倍半萜生物合成 | WP_043653400 | (+)-4-epi-cubebol synthase | 催化 | 异源表达于E. coli BL21，催化FPP生成(+)-4-epi-cubebol及少量cubebol、germacrene D-4-ol和δ-cadinene |
| Streptomyces viridochromogenes DSM 40736 | 倍半萜生物合成 | WP_003994861 | (-)-7-epi-α-eudesmol synthase | 催化 | 异源表达于E. coli BL21，催化FPP生成(-)-7-epi-α-eudesmol及hedycaryol |
| Chitinophaga pinensis DSM 2588 | 倍半萜生物合成 | WP_012792334 | (-)-γ-cadinene synthase | 催化 | 异源表达于E. coli BL21，催化FPP生成(-)-γ-cadinene及痕量α-和δ-cadinene |
| Saccharothrix espanaiensis DSM 44229 | 倍半萜生物合成 | WP_015102836 | (-)-(E)-β-caryophyllene synthase | 催化 | 异源表达于E. coli BL21，催化FPP生成(-)-(E)-β-caryophyllene |
关键发现
- 六种酶的产物经NMR和旋光表征：(-)-α-amorphene（1）产率6 mg，[α]D22=-44.9 (c
- 15, CH2Cl2)；(+)-T-muurolol（2）产率32 mg，[α]D23=+99.4 (c
- 10, CH2Cl2)；(+)-4-epi-cubebol（3）产率7 mg，[α]D24=+7.1 (c
- 29, CH2Cl2)；(-)-7-epi-α-eudesmol（4）产率6 mg，[α]D22=-51.3 (c
- 27, C6D6)；(-)-γ-cadinene（5）产率2.6 mg，[α]D22=-32.3 (c
- 05, CH3OH)；(-)-(E)-β-caryophyllene（6）产率2.1 mg，[α]D24=-14.0 (c
- 13, CH2Cl2)。在D2O中用(6-13C)FPP孵育7-epi-α-eudesmol合成酶，产物C-6出现氘代导致的13C三重峰（δ38.7 ppm, 1JCD=19.4 Hz），证明hedycaryol再质子化。用(13-13C)FPP孵育六种酶，标记分别出现在21.7、15.3、20.3、28.6、15.3、22.8 ppm，证明所有六种酶均严格区分FPP末端E/Z甲基。
研究结论
六种细菌倍半萜环化酶的产物被完整表征，体内体外实验结果一致；7-epi-α-eudesmol生物合成通过hedycaryol的再质子化进行；所有六种酶对FPP环化均显示严格的立体化学控制。细菌产生的倍半萜多数为植物对映体的相反构型，可能构成互不干扰的化学通讯渠道。