高级醇 · 代谢工程文献库

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Enhancement of astaxanthin production in Xanthophyllomyces dendrorhous by efficient method for the complete deletion of genes

作者
Keisuke Yamamoto, Kiyotaka Y. Hara, Toshihiko Morita, Akira Nishimura, Daisuke Sasaki, Jun Ishii, Chiaki Ogino, Noriyuki Kizaki, Akihiko Kondo
单位
Department of Chemical Science and Engineering, Graduate School of Engineering, Kobe University, 1-1 Rokkodaiho, Nada-ku, Kobe 657-8501, Japan; Division of Environmental and Life Sciences, Graduate Division of Nutritional and Environmental Sciences, University of Shizuoka, 52-1 Yada, Suruga-ku, Shizuoka 422-8526, Japan; Organization of Advanced Science and Technology, Kobe University, 1-1 Rokkodaiho, Nada-k, Kobe 657-8501, Japan; Medical Device Development Laboratories, Kaneka Corporation, Takasago, Hyogo, Japan; Graduate School of Science, Technology, and Innovation, Kobe University, 1-1 Rokkodai-cho, Nada-ku, Kobe, Hyogo 657-8501, Japan; Biotechnology Development Laboratories, Kaneka Corporation, Takasago, Hyogo, Japan
杂志
Microbial Cell Factories（2016）
DOI
10.1186/s12934-016-0556-x
所属领域
代谢工程
关键词
Xanthophyllomyces dendrorhous代谢工程基因删除虾青素生产酵母
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解决的核心问题

红酵母 Xanthophyllomyces dendrorhous 中缺乏高效删除二倍体靶基因的方法，难以通过解除麦角固醇对甲羟戊酸途径的反馈抑制来进一步提高虾青素产量。

研究策略

利用单一抗生素抗性基因（G418）通过逐步增加抗生素浓度的培养压力，先插入破坏盒删除一个 CYP61 等位基因，再通过同源重组和筛选实现双等位基因的完全删除。

研究路线图

100%
研究问题：红酵母缺乏高效删除二倍体靶基因的方法，麦角固醇反馈抑制限制虾青素产量
策略：单一G418抗性基因，逐步增加抗生素浓度培养压力，插入破坏盒先删除一个CYP61等位基因
关键改造：同源重组 + G418筛选，逐步实现CYP61双等位基因完全删除（获得5个双缺失菌株）
结果：双缺失菌株72小时未检测到麦角固醇，虾青素产量达1.65 mg/L（较野生型提高1.4倍）
结论：简单高效的双等位基因删除方法，解除反馈抑制显著提高虾青素产量，可推广至异戊二烯化合物生产
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核心内容

针对红酵母Xanthophyllomyces dendrorhous缺乏高效删除二倍体靶基因方法的问题，该研究开发了一种利用单一G418抗性标记实现双等位基因完全删除的新策略。通过逐步增加抗生素浓度进行培养压力筛选，先插入破坏盒删除一个CYP61等位基因，再经同源重组实现第二个等位基因的完全删除。结果显示，从60个菌落中获得5个双缺失菌株，双缺失菌株在72小时内未检测到麦角固醇合成，而野生型在24小时后即停止合成。双缺失菌株虾青素产量达1.65 mg/L，较野生型的1.22 mg/L提高约1.4倍，而单缺失菌株产量几乎不变。研究表明，CYP61完全缺失能有效解除麦角固醇对甲羟戊酸途径的反馈抑制，其增产效果与过表达合成基因相当，该方法有望应用于该菌株中多种异戊二烯化合物的工业生产。

创新点

开发了使用单一抗性标记高效删除二倍体靶基因的新方法；首次在 X. dendrorhous 中实现了 CYP61 双等位基因完全删除；证明双缺失比单缺失更有效提高虾青素产量。

研究对象（1）

底盘细胞代谢通路基因蛋白功能说明
Xanthophyllomyces dendrorhous 麦角固醇生物合成/甲羟戊酸途径 CYP61 C-22 sterol desaturase 调控 编码C-22固醇去饱和酶，其催化产物麦角固醇反馈抑制甲羟戊酸途径中的HmgS和HmgR，通过双等位基因删除解除抑制。

关键发现

  1. 通过逐步增加 G418 浓度从 60 个菌落中获得 5 个双 CYP61 缺失菌株；双缺失菌株在 72 小时内未检测到麦角固醇合成，而野生型和单缺失菌株在 24 小时后停止合成；双缺失菌株在 72 小时虾青素产量为
  2. 65 mg/L，较野生型
  3. 22 mg/L 提高约
  4. 4 倍，单缺失菌株为
  5. 25 mg/L 几乎不变；论文指出 CYP61 缺失可使虾青素产量提高约
  6. 6 倍，与过表达合成基因的
  7. 5 倍相当。

研究结论

开发了一种简单高效的双等位基因删除方法，通过完全删除 CYP61 基因降低了麦角固醇合成，解除其对甲羟戊酸途径的反馈抑制，显著提高了虾青素产量。该方法有望用于 X. dendrorhous 中多种异戊二烯化合物的工业生产，且不会因意外突变导致细胞生长下降。