Biosynthesis of phlorisovalerophenone and 4-hydroxy-6-isobutyl-2-pyrone in Escherichia coli from glucose
- 作者
- Wei Zhou, Yibin Zhuang, Yanfen Bai, Huiping Bi, Tao Liu, Yanhe Ma
- 单位
- 中国科学院天津工业生物技术研究所；中国科学院系统微生物生物技术重点实验室；中国科学院大学
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2016）
- DOI
- 10.1186/s12934-016-0549-9
- 所属领域
- 代谢工程、合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在大肠杆菌中缺乏短支链酰基辅酶A（尤其是异戊酰辅酶A）的天然合成途径，导致以异戊酰辅酶A为前体的酰基间苯三酚及TAL类似物（如PIVP和HIBP）难以通过微生物从可再生碳源高效合成，已有途径往往产生混合酰基辅酶A并受氨基酸代谢干扰。
研究策略
构建一条经羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）合成异戊酰辅酶A的新途径（引入酿酒酵母ERG10/ERG13和粘细菌LiuC/AibA/B/AibC），再分别引入三种植物来源的III型聚酮合酶（啤酒花HIVPS、草莓FvCHS2-1、贯叶连翘HpCHS）到同一大肠杆菌菌株中，实现PIVP和HIBP的体内合成，并优化诱导温度、IPTG浓度和发酵时间。
核心内容
该研究在大肠杆菌中实现了从葡萄糖直接生物合成两种酰基间苯三酚衍生物——苯戊酮间苯三酚（PIVP）和4-羟基-6-异丁基-2-吡喃酮（HIBP）。由于大肠杆菌缺乏异戊酰辅酶A的天然合成途径，作者构建了一条基于羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）的新途径，引入酿酒酵母的ERG10/ERG13以及粘细菌的LiuC/AibA/B/AibC酶，避免了传统BCDH途径产生多种支链酰基辅酶A混合物的问题。在此基础上，分别表达来自啤酒花、草莓和贯叶连翘的三种III型聚酮合酶，获得三个产PIVP和HIBP的菌株。其中异戊酰辅酶A滴度达1421.8 nmol/g湿重，较BCDH途径提高约16倍；最高PIVP和HIBP滴度分别为6.4 mg/L和66.5 mg/L。通过优化诱导温度（23°C）、IPTG浓度（0.05 mM）和发酵时间，显著提升了产物积累。该研究首次在大肠杆菌中实现从葡萄糖同时合成PIVP和HIBP，并通过1D-NMR确认了HIBP结构，为酰基间苯三酚类化合物的微生物制造提供了可行策略。
创新点
['首次在大肠杆菌中实现从葡萄糖同时生物合成PIVP和HIBP', '构建产异戊酰辅酶A的HMG-CoA途径，避免BCDH途径产生多种支链酰基辅酶A的混合物', '新克隆了贯叶连翘查尔酮合酶HpCHS（GenBank: KU180217）并在体内验证其功能', '首次通过1D-NMR确认了HIBP的结构（此前仅用LC-MS推测）', '获得的最高PIVP滴度为6.4 mg/L，HIBP滴度为66.5 mg/L']
研究对象（9）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊酰辅酶A生物合成途径（基于HMG-CoA） | ERG10 | 乙酰辅酶A乙酰转移酶 (acetyl-CoA acetyltransferase) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化两分子乙酰辅酶A缩合生成乙酰乙酰辅酶A |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊酰辅酶A生物合成途径（基于HMG-CoA） | ERG13 | HMG-CoA合酶 (HMG-CoA synthase) | 催化 | 来自酿酒酵母，催化乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A缩合生成HMG-CoA |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊酰辅酶A生物合成途径（基于HMG-CoA） | liuC | HMG-CoA脱水酶 (HMG-CoA dehydratase) | 催化 | 来自粘细菌Myxococcus xanthus，催化HMG-CoA脱水生成3-甲基戊烯二酰辅酶A（MG-CoA） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊酰辅酶A生物合成途径（基于HMG-CoA） | aibA | MG-CoA脱羧酶亚基 (3-methylglutaconyl-CoA decarboxylase subunit) | 催化 | 来自Myxococcus xanthus，与AibB共同作用催化MG-CoA脱羧生成3,3-二甲基丙烯酰辅酶A（DMA-CoA） |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊酰辅酶A生物合成途径（基于HMG-CoA） | aibB | MG-CoA脱羧酶亚基 | 催化 | 来自Myxococcus xanthus，与AibA组成脱羧酶复合体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 异戊酰辅酶A生物合成途径（基于HMG-CoA） | aibC | DMA-CoA还原酶 (3,3-dimethylacryloyl-CoA reductase) | 催化 | 来自Myxococcus xanthus，还原DMA-CoA生成异戊酰辅酶A |
| Escherichia coli BL21(DE3) | PIVP/HIBP生物合成途径（III型聚酮合酶） | HIVPS | 戊苯酮合酶 (valerophenone synthase) | 催化 | 来自啤酒花Humulus lupulus，经密码子优化，以异戊酰辅酶A为起始底物与3分子丙二酰辅酶A缩合，主要生成PIVP并副产HIBP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | PIVP/HIBP生物合成途径（III型聚酮合酶） | FvCHS2-1 | 查尔酮合酶 (chalcone synthase) | 催化 | 来自草莓Fragaria vesca，经密码子优化，双功能CHS/VPS，可生成PIVP和HIBP |
| Escherichia coli BL21(DE3) | PIVP/HIBP生物合成途径（III型聚酮合酶） | HpCHS | 查尔酮合酶 (chalcone synthase) | 催化 | 从贯叶连翘Hypericum perforatum愈伤组织克隆（GenBank: KU180217），主要催化HIBP合成，PIVP产量较低 |
关键发现
- 构建的异戊酰辅酶A途径在大肠杆菌中实现滴度1421.8±129.2 nmol/g湿重，比基于BCDH复合物的途径提高约16倍；菌株APG-1（携带HIVPS）产生PIVP
- 4±0.6 mg/L、HIBP
- 0±7.9 mg/L；菌株APG-2（携带FvCHS2-1）产生PIVP
- 4±0.2 mg/L、HIBP
- 3±9.0 mg/L；菌株APG-3（携带HpCHS）产生HIBP最高66.5±13.1 mg/L、PIVP
- 8±0.5 mg/L；三种菌株HIBP/PIVP比例分别为8:1、37:1和24:1；最佳发酵条件为23°C诱导、0.05 mM IPTG、发酵24小时；从2 L发酵液中纯化获得74.9 mg HIBP和6.5 mg PIVP；HpCHS与FvCHS2-1的氨基酸序列相似性为96.2%。
研究结论
本研究通过在大肠杆菌中导入经HMG-CoA的异戊酰辅酶A合成途径及不同来源的III型聚酮合酶，成功实现了从葡萄糖生物合成PIVP和HIBP，为酰基间苯三酚衍生物和“非天然”三乙酸内酯类似物的微生物制造提供了新范例和基础。