Expression of Recombinant Proteins in the Methylotrophic Yeast Pichia pastoris
- 作者
- Maria Weidner, Marcus Taupp, Steven J. Hallam
- 单位
- Department of Microbiology and Immunology, University of British Columbia - UBC
- 杂志
- Journal of Visualized Experiments（2010）
- DOI
- 10.3791/1862
- 所属领域
- 发酵工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何利用甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母高效表达和纯化重组蛋白
研究策略
采用毕赤酵母作为真核表达宿主，利用甲醇诱导型AOX1启动子驱动外源基因表达，通过α-因子信号肽将重组蛋白分泌至培养基中，并采用Zeocin抗性筛选转化子，通过Western blot和His标签纯化检测目标蛋白
核心内容
本研究建立了一套基于甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母的重组蛋白表达与纯化标准化流程。利用甲醇严格调控的AOX1启动子驱动外源基因表达，通过α-因子信号肽将目标蛋白分泌至胞外培养基，并借助pPICZαA载体上携带的c-myc表位和6xHis标签实现蛋白的免疫检测与一步亲和纯化。实验中采用电穿孔法转化毕赤酵母，电击参数为1500V、25μF、200Ω，产生约7500V/cm场强和10ms脉冲；阳性转化子以100μg/mL Zeocin筛选。甲醇诱导时，将菌液OD600控制在1.3–1.5，以0.5%终浓度甲醇诱导，并在6至48小时不同时间点取样检测。结果显示，四个目标蛋白（1605、0537、1228和1682）在诱导24小时后均能通过Western blot检测到分泌表达。该流程操作简便、成本低廉，为真核重组蛋白的制备提供了可靠方案，所附标签也便于后续的鉴定和纯化。
创新点
提供了从电转化、甲醇诱导表达到检测的完整标准化流程；使用pPICZαA载体同时整合AOX1严格调控启动子、α-因子分泌信号、c-myc表位和6xHis标签，便于目标蛋白的分泌、鉴定和一步纯化
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Pichia pastoris（巴斯德毕赤酵母） | 甲醇代谢途径 | AOX1 | 醇氧化酶（AOX1） | 催化 | AOX1是甲醇代谢的关键酶，其强启动子受甲醇严格诱导，用于驱动外源基因表达 |
| Pichia pastoris（巴斯德毕赤酵母） | 外源基因表达 | AOX1启动子 | — | 调控 | 甲醇诱导型强启动子，严格调控下游外源基因的转录 |
| Pichia pastoris（巴斯德毕赤酵母） | 分泌途径 | MFα1 | α-因子信号肽 | 转运 | 来源于酿酒酵母的α-因子前体信号肽，引导重组蛋白进入分泌途径并分泌到培养基中 |
关键发现
- 成功在Pichia pastoris中表达多种重组蛋白（图1中1605、0537、1228和1682四个蛋白在甲醇诱导24小时后可检测到）
- 最佳培养条件为将OD600控制在1.3-1.5
- 电穿孔参数为1500V、25μF、200Ω，产生约10ms脉冲和约7500V/cm场强
- 甲醇诱导终浓度为0.5%
- Zeocin筛选浓度为100μg/mL
- 表达时间点可选取6h、12h、24h、36h、48h。
研究结论
实验表明，Pichia pastoris在AOX1严格调控下可实现重组蛋白的甲醇诱导分泌表达，该流程操作简便、成本低，适合真核重组蛋白的制备，并可通过c-myc/His标签进行鉴定和纯化。