Monoterpene production by the carotenogenic yeast Rhodosporidium toruloides
- 作者
- Xun Zhuang, Oliver Kilian, Eric Monroe, Masakazu Ito, Mary Bao Tran-Gymnf, Fang Liu, Ryan W. Davis, Mona Mirsiahqi, Eric Sundstrom, Todd Pray, Jeffrey M. Skerker, Anthe George, John M. Gladden
- 单位
- Biomass Science and Conversion Technology, Sandia National Laboratories; Advanced Biofuels Process Development Unit (ABPDU), Lawrence Berkeley National Laboratory; Energy Bioscience Institute, 2151 Berkeley Way; Lawrence Berkeley National Laboratory; Deconstruction Division, Joint BioEnergy Institute/Sandia National Laboratories
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1099-8
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
利用产类胡萝卜素的红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides从木质纤维素生物质生产单萜类生物燃料，克服模式菌株（如酿酒酵母）不能天然利用木糖且单萜合成前体GPP供应不足的瓶颈。
研究策略
在R. toruloides中异源表达16种来自植物、细菌和真菌的单萜合酶基因，通过ATMT和电穿孔两种转化方法随机整合，利用正十二烷覆盖和SPME检测产物，评估9种单萜的生产能力；对最高产的1,8-桉叶素合成酶Hyp3进行进一步优化，并在2L生物反应器中验证利用木质纤维素水解液生产；同时测定1,8-桉叶素的燃料性质。
核心内容
本研究在产类胡萝卜素酵母红冬孢酵母中系统评估了异源表达16种植物、细菌和真菌来源单萜合酶以生产单萜类生物燃料的可行性。通过农杆菌介导转化和电穿孔两种方法随机整合基因，利用正十二烷覆盖和固相微萃取检测产物，发现8种合酶功能表达并成功生产7种单萜。其中1,8-桉叶素合酶Hyp3产量最高，在YPD培养基中达14.94 mg/L，在75%玉米秸秆水解液中摇瓶产量达27.64 mg/L，2L生物反应器中达34.6 mg/L。法尼醇检测结果表明GPP前体供应仍受限制。燃料性质测定显示1,8-桉叶素的辛烷值RON为99.2、MON为91.0，能量密度33.5 MJ/L，抗爆指数95.1，符合优质汽油标准。该研究首次证明红冬孢酵母能天然利用木质纤维素水解液生产非天然单萜，为利用廉价的木质纤维素原料生产高价值生物燃料提供了新的微生物平台，1,8-桉叶素有望成为火花点火发动机的潜在替代燃料或调合组分。
创新点
首次在R. toruloides中系统评估多种异源单萜合酶；证明该酵母能天然利用木质纤维素水解液（如DMR-EH）生产非天然单萜；鉴定1,8-桉叶素为具有潜力的高能量密度火花点火发动机燃料，其RON/MON和抗爆指数达到现代汽油标准。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Rhodosporidium toruloides IFO0880 | 甲羟戊酸(MVA)途径 | — | — | — | 产类胡萝卜素的产油酵母，天然具有MVA途径和单萜前体GPP |
| — | 甲羟戊酸(MVA)途径 | ERG20 | GPP/FPP合酶 | 催化 | 内源基因，主要催化生成FPP，导致GPP池较低 |
| — | 单萜生物合成 | Hyp3 | 1,8-桉叶素合酶 | 催化 | 来自Hypoxylon sp. E74060B，产量最高；Km=2.5±0.6 μM，Kcat=0.295 s⁻¹ |
| — | 单萜生物合成 | SSCG_00536 CnsA | 1,8-桉叶素合酶 | 催化 | 来自Streptomyces clavuligerus，仅痕量产物 |
| — | 单萜生物合成 | ama0e23 | (E)-β-罗勒烯合酶 | 催化 | 来自Antirrhinum majus，产生(E)-β-ocimene及微量(Z)-β-ocimene和月桂烯 |
| — | 单萜生物合成 | Ag10 | 柠檬烯合酶 | 催化 | 来自Abies grandis，主要产生柠檬烯及少量α-蒎烯和β-蒎烯 |
| — | 单萜生物合成 | PT30 | α-蒎烯合酶 | 催化 | 来自Pinus taeda，只产生α-蒎烯 |
| — | 单萜生物合成 | AG3.18 | 蒎烯合酶 | 催化 | 来自Abies grandis，产生α-和β-蒎烯 |
| — | 单萜生物合成 | SabS1 | 桧烯合酶 | 催化 | 来自Salvia pomifera，产生桧烯及其他少量单萜 |
| — | 单萜生物合成 | TpsB | 3-蒈烯合酶 | 催化 | 来自Salvia stenophylla，主要产生3-蒈烯，另有月桂烯、4-蒈烯等 |
| — | 单萜/倍半萜生物合成 | FaNES1 | 芳樟醇/橙花叔醇合酶 | 催化 | 来自草莓，双功能酶，用于检测GPP和FPP池，仅检测到橙花叔醇 |
关键发现
- 在R. toruloides中，16种单萜合酶中有8种功能表达，成功生产7种单萜
- 其中Hyp3（1,8-桉叶素合酶）产量最高，在YPD培养基中达到14.94±1.84 mg/L，电穿孔和ATMT转化分别获得最高15.45 mg/L和15.81 mg/L
- 在75% DMR-EH玉米秸秆水解液中摇瓶产量达27.64 mg/L，2L生物反应器中达34.6 mg/L，mock培养基中达47.3 mg/L
- 表达FaNES1检测GPP/FPP池，仅检测到法尼醇（最高24 mg/L）而无芳樟醇，表明GPP供应受限
- 1,8-桉叶素的燃料性质：RON=99.2，MON=91.0，能量密度33.5 MJ/L，水溶性3.5 g/L，AKI=95.1，符合优质汽油标准。
研究结论
R. toruloides是一个适合从木质纤维素生物质生产非天然单萜（尤其是1,8-桉叶素）的微生物平台，1,8-桉叶素可作为火花点火和压燃发动机的潜在生物燃料或调合组分。