Exploring natural biodiversity to expand access to microbial terpene synthesis
- 作者
- Juan Rico, Katia Duquesne, Jean-Louis Petit, Aline Mariage, Ekaterina Darii, Frédéric Peruch, Véronique de Berardinis, Gilles lacazio
- 单位
- Aix-Marseille Univ, CNRS, Centrale Marseille, iSm2, Marseille, France; CNRS, LCPO, UMR 5629, Univ. Bordeaux, Bordeaux INP, 33600 Pessac, France; Genomique metabolique, Genoscope, Institut Francois Jacob, CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay, 91057 Evry, France
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2019）
- DOI
- 10.1186/s12934-019-1074-4
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
- 阅读原文
- 查看 PDF 原文
解决的核心问题
如何利用天然生物多样性筛选高效的异戊烯基磷酸激酶（IPK），建立从廉价C5醇（异戊烯醇和二甲基烯丙醇）合成IPP/DMAPP的半合成途径，从而扩展微生物萜烯合成能力，并实现神经孢烯（neurosporene）的高效微生物生产。
研究策略
通过序列驱动的in silico方法从生物多样性中选取93个IPK候选基因，经体外酶活筛选和体内类胡萝卜素生产验证，挑选出5个最有潜力的IPK；在大肠杆菌中表达完整番茄红素合成途径（CrtE/CrtB/CrtI），以类胡萝卜素颜色为筛选标记，评估IPK在体内的IPP/DMAPP供给能力，并优化质粒拷贝数和底物配比。
核心内容
该研究旨在通过挖掘天然生物多样性中的异戊烯基磷酸激酶（IPK），建立从廉价C5醇（异戊烯醇和二甲基烯丙醇）合成IPP/DMAPP的半合成途径，以扩展微生物萜烯合成能力。研究者采用序列驱动的in silico方法从生物多样性中选取93个IPK候选基因，经体外酶活筛选和体内类胡萝卜素生产验证后，挑选出5个最有潜力的IPK，并在大肠杆菌中表达完整的番茄红素合成途径，以类胡萝卜素颜色为筛选标记评估IPK的体内前体供给能力。结果显示，来自Methanococcoides burtonii的IPK（Q12TH9）表现最佳，仅通过更换该IPK，无需额外代谢工程改造，总类胡萝卜素产量提高约18倍（17.9±1.7倍），神经孢烯产量提高超过45倍（46.0±5.2倍）。在50 mL培养中，神经孢烯产量达702.1±44.7 μg/g DCW和966.2±61.6 μg/L，且占总类胡萝卜素约90%。该半合成途径简化了萜烯前体供给，具有可扩展性，为微生物生产神经孢烯及其他萜烯提供了新策略。
创新点
1. 建立了基于类胡萝卜素颜色的体内筛选平台，可快速评估IPK功能；2. 从生物多样性中鉴定出多个新IPK，其中来自Methanococcoides burtonii的IPK（Q12TH9）表现最佳，能同时将IOH和DMAOH磷酸化为IPP/DMAPP；3. 仅通过更换IPK，无需其他代谢工程改造，即实现总类胡萝卜素产量约18倍提高、神经孢烯产量>45倍提高，且神经孢烯占类胡萝卜素总量约90%，为神经孢烯的微生物合成提供了新途径。
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素合成途径（番茄红素/神经孢烯） | crtE, crtB | GGPP合酶（CrtE）和八氢番茄红素合酶（CrtB） | 催化 | 来自Pantoea agglomerans，用于合成类胡萝卜素前体 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 类胡萝卜素合成途径（番茄红素/神经孢烯） | crtI | 八氢番茄红素脱氢酶（CrtI） | 催化 | 来自Rhodobacter sphaeroides，具有泄漏性脱氢酶活性，可产生番茄红素和神经孢烯 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜烯前体合成（IPP/DMAPP替代途径） | ipk-ta | 异戊烯基磷酸激酶（IPK-ta） | 催化 | 来自Thermoplasma acidophilum，能够催化IOH/DMAOH磷酸化，作为参考和验证对象 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜烯前体合成（IPP/DMAPP替代途径） | ipk-mv | 异戊烯基磷酸激酶（IPK-mv） | 催化 | 来自Methanococcus vannielii，体内筛选表现较好，与IPK-ta同源性较低 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜烯前体合成（IPP/DMAPP替代途径） | ipk-mt | 异戊烯基磷酸激酶（IPK-mt） | 催化 | 来自Methanolobus tindarius，高拷贝质粒下总类胡萝卜素提高12.0倍，与IPK-mb共享63%同一性 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜烯前体合成（IPP/DMAPP替代途径） | ipk-mz | 异戊烯基磷酸激酶（IPK-mz） | 催化 | 来自Methanosalsum zhilinae，体内筛选提高4.4倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜烯前体合成（IPP/DMAPP替代途径） | ipk-mm | 异戊烯基磷酸激酶（IPK-mm） | 催化 | 来自Methanococcus maripaludis，体内筛选提高3.9倍 |
| Escherichia coli BL21(DE3) | 萜烯前体合成（IPP/DMAPP替代途径） | ipk-mb | 异戊烯基磷酸激酶（IPK-mb） | 催化 | 来自Methanococcoides burtonii（UniProt ID: Q12TH9），最佳IPK，使总类胡萝卜素提高约18倍，神经孢烯提高>45倍 |
关键发现
- 从93个IPK中成功克隆82个基因，64个在大肠杆菌中过表达，39个在体外有活性，选出5个进行体内验证。最佳IPK来自Methanococcoides burtonii（UniProt ID: Q12TH9），使总类胡萝卜素产量提高约18倍（17.9±1.7倍），神经孢烯产量提高>45倍（46.0±5.2倍）。在50 mL培养中，神经孢烯产量达702.1±44.7 μg/g DCW和966.2±61.6 μg/L
- 在4 L批次发酵中，神经孢烯产量为604.8±68.3 μg/g DCW和430.5±48.6 μg/L，神经孢烯占总类胡萝卜素约88-90%。对照（无底物培养）中，番茄红素约占63.5%、神经孢烯约占36.5%
- 添加18 mM IOH和6 mM DMAOH后，神经孢烯占比升至约93.9%。使用高拷贝质粒pRSFDuet-1比中拷贝pCDFDuet-1效果更好，IPK-ta在中等拷贝时仅提高85%，在高拷贝时提高9倍。
研究结论
通过筛选IPK生物多样性，在仅含有番茄红素合成途径（CrtE、CrtB、CrtI）和IPK的大肠杆菌中，无需额外代谢工程即可显著提高类胡萝卜素产量，神经孢烯产量提高超过45倍，最高达702 μg/g DCW（966 μg/L），且神经孢烯纯度约90%。该半合成途径简化了萜烯前体供给，具有可扩展性，为微生物生产神经孢烯及其他萜烯提供了新策略。