Construction of Escherichia coli cell factories for crocin biosynthesis

作者: Wen Wang, Ping He, Dongdong Zhao, Lijun Ye, Longhai Dai, Xueli Zhang, Yuanxia Sun, Jing Zheng, Changhao Bi
杂志: Microbial Cell Factories（2019）
DOI: 10.1186/s12934-019-1166-1
所属领域: 代谢工程/合成生物学
关键词: CrocetinCrocinEscherichia coliGlycosyltransferaseSaffron stigma
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解决的核心问题

缺乏经济环保的藏红花素（crocin）生产方法，传统提取依赖藏红花柱头，成本高且破坏环境；需要构建微生物细胞工厂实现从简单碳源合成crocin。

研究策略

基于产zeaxanthin的大肠杆菌菌株，异源表达类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD2）、醛脱氢酶（ALD）和糖基转移酶（UGT），通过筛选关键酶、优化表达（质粒/染色体整合、不同强度启动子、发酵温度）构建crocetin和crocin合成途径。

研究路线图

100%

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核心内容

针对藏红花素依赖植物提取、成本高且不环保的问题，该研究在产玉米黄素的大肠杆菌YL4中构建了异源藏红花素合成途径。通过筛选关键酶，发现CsCCD2能将玉米黄素裂解为藏红花素二醛，而CsZCD和CaCCD2无活性；醛脱氢酶ALD8比ALD3更高效地将二醛氧化为藏红花酸。将筛选出的基因组合整合至质粒并优化发酵条件，最优菌株经48小时发酵产藏红花酸4.42 mg/L（0.51 mg/g DCW）。针对植物源糖基转移酶UGT94E5和UGT75L6在大肠杆菌中活性低的问题，研究采用枯草芽孢杆菌来源的YjiC、YdhE和YojK替代，体外实验表明三者均能催化藏红花酸生成不同藏红花素衍生物，其中YojK活性最高，可生成藏红花素-1至藏红花素-5。最终工程菌株发酵72小时后通过HPLC和LC-ESI-MS检测到藏红花素-5（m/z=491.22），但未定量。该工作首次在大肠杆菌中实现从简单碳源合成藏红花素，以微生物源糖基转移酶解决了植物酶适配性差的瓶颈，为藏红花素的微生物规模化生产奠定了基础。

创新点

首次在大肠杆菌中构建异源crocin合成途径；用枯草芽孢杆菌的糖基转移酶YjiC/YdhE/YojK替代植物源UGT94E5/UGT75L6，解决了植物酶在细菌中活性低的问题；获得产crocetin（4.42 mg/L）和crocin-5的大肠杆菌细胞工厂。

研究对象（13）

底盘细胞	代谢通路	基因	蛋白	功能	说明
E. coli YL4	zeaxanthin→crocetin dialdehyde	CsCCD2	类胡萝卜素裂解双加氧酶CsCCD2	催化	来自Crocus sativus，催化zeaxanthin的7,8和7',8'双键裂解生成crocetin dialdehyde
E. coli YL4	zeaxanthin→crocetin dialdehyde	CsZCD	玉米黄素裂解双加氧酶CsZCD	催化	来自Crocus sativus，本文中未检测到催化活性
E. coli YL4	zeaxanthin→crocetin dialdehyde	CaCCD2	类胡萝卜素裂解双加氧酶CaCCD2	催化	来自Crocus ancyrensis，本文中未检测到催化活性
E. coli YL4	crocetin dialdehyde→crocetin	ALD8	醛脱氢酶ALD8	催化	来自Neurospora crassa，可将crocetin dialdehyde氧化为crocetin，活性较高
E. coli YL4	crocetin dialdehyde→crocetin	ALD3	醛脱氢酶ALD3	催化	来自Crocus sativus，可将crocetin dialdehyde氧化为crocetin，但产量低于ALD8
E. coli YL4	crocetin dialdehyde→crocetin	ALD6	醛脱氢酶ALD6	催化	来自Crocus sativus，无活性
E. coli YL4	crocetin dialdehyde→crocetin	ALD9	醛脱氢酶ALD9	催化	来自Crocus sativus，无活性
E. coli YL4/BL21(DE3)	crocetin→crocin	UGT94E5	糖基转移酶UGT94E5	催化	来自Gardenia jasminoides，在大肠杆菌中表达量低，体外无活性
E. coli YL4/BL21(DE3)	crocetin→crocin	UGT75L6	糖基转移酶UGT75L6	催化	来自Gardenia jasminoides，体外仅检测到微弱活性
E. coli YL4	crocetin→crocin	YjiC	糖基转移酶YjiC	催化	来自Bacillus subtilis，体外催化生成crocin-4/crocin-3，活性较低
E. coli YL4	crocetin→crocin	YdhE	糖基转移酶YdhE	催化	来自Bacillus subtilis，体外催化生成crocin-5和crocin-4/crocin-3
E. coli YL4	crocetin→crocin	YojK	糖基转移酶YojK	催化	来自Bacillus subtilis，体外活性最高，可生成crocin-1至crocin-5
E. coli YL5	zeaxanthin生物合成	crtZ	β-胡萝卜素羟化酶CrtZ	催化	整合于染色体提高zeaxanthin产量，本文作为宿主菌株的构建基础

关键发现

CsCCD2可催化zeaxanthin生成crocetin dialdehyde，而CsZCD和CaCCD2无活性；ALD8和ALD3可将crocetin dialdehyde氧化为crocetin，其中ALD8活性更高；最优菌株YL4(pCsCCD2-UGT94E5-UGT75L6,pTrc-ALD8)经48 h发酵产crocetin
42 mg/L（0.51 mg/g DCW）；染色体整合菌株YL5-46-CsCCD2-ALD8产crocetin
77 mg/L（82.95 μg/g DCW）；体外糖基化实验显示YjiC、YdhE、YojK能催化crocetin生成不同crocin衍生物，其中YojK活性最高，可产生crocin-1至crocin-5；最终菌株YL4(pCsCCD2-UGT94E5-UGT75L6,pTrc-ALD8,pET28a-YjiC-YdhE-YojK)发酵72 h后经HPLC和LC-ESI-MS检测到crocin-5（m/z=491.22，tR=22.10 min），但未定量；植物源UGT94E5和UGT75L6在大肠杆菌中表达量低且几乎无活性。

研究结论

成功在大肠杆菌中构建了crocetin和crocin-5的异源合成途径，通过筛选微生物源糖基转移酶替代植物酶，获得了产crocetin和crocin-5的细胞工厂，为规模化生产藏红花素及其衍生物奠定了基础。