Functional characterisation of twelve terpene synthases from actinobacteria
- 作者
- Anuj K. Chhalodia, Houchao Xu, Georges B. Tabekoueng, Binbin Gu, Kizerbo A. Taizoumbe, Lukas Lauterbach, Jeroen S. Dickschat
- 单位
- Kekule-Institute of Organic Chemistry and Biochemistry, University of Bonn, Gerhard-Domagk-Straße 1, 53121 Bonn, Germany
- 杂志
- Beilstein Journal of Organic Chemistry（2023）
- DOI
- 10.3762/bjoc.19.100
- 所属领域
- 合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
从放线菌中发现并表征功能未知的I型萜烯合酶，拓展对细菌萜类生物合成酶催化多样性的认识，并寻找具有新功能的酶。
研究策略
基于对4018个细菌萜烯合酶氨基酸序列的系统发育分析，选取15个未表征的酶同源物，在大肠杆菌中异源表达并纯化，分别以GPP、FPP、GGPP和GFPP为底物进行体外酶促反应，通过GC-MS初步鉴定产物，对重要新产物进行制备规模反应、NMR结构解析和旋光度测定。
核心内容
本研究基于4018个细菌萜烯合酶氨基酸序列的系统发育分析，选取15个未表征的同源酶在大肠杆菌中异源表达纯化，分别以GPP、FPP、GGPP和GFPP为底物进行体外酶促反应并结合GC-MS鉴定产物。其中12个酶具有催化活性：首次发现KkdCS和SjaCS分别催化FPP生成(+)-δ-cadinol（制备产量5.5 mg，产率14%）和(+)-α-cadinene（1.3 mg，产率3.5%），并通过NMR和旋光度确认了立体构型；两个细菌源(-)-amorpha-4,11-diene合酶（SIADS和SsADS）被鉴定，SIADS产量1 mg（产率2.6%）；NbEIZS在催化FPP生成epi-isozizane的同时展现出单萜合酶侧活性，可产生9种单萜；KkAS以GGPP为底物高效生成allokutznerene，SSS以GFPP为底物生成sesterviolene；另有3个酶无表达或无活性。研究证明系统发育驱动的功能筛选是发现新型萜烯合酶的有效策略，但底物链长无法仅凭系统发育预测；新发现的(-)-amorpha-4,11-diene合酶可为青蒿素合成途径重构提供元件，这些数据也为未来机器学习预测萜烯合酶功能奠定了基础。
创新点
首次鉴定出催化(+)-δ-cadinol和(+)-α-cadinene生成的萜烯合酶；发现两个细菌来源的(-)-amorpha-4,11-diene合酶；发现新的epi-isozizane合酶具有单萜合酶侧活性；鉴定出选择性产生allokutznerene的二萜合酶；发现一个与已知酶同源的sesterviolene合酶。
研究对象（12）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | KkdCS | 催化 | 来自Kutzneria kofuensis，催化FPP生成(+)-δ-cadinol，首次发现此功能 |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | SjaCS | 催化 | 来自Streptomyces jumonjiensis，催化FPP生成(+)-α-cadinene，首次发现此功能 |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | SIADS | 催化 | 来自Streptomyces lavendulae，催化FPP生成(-)-amorpha-4,11-diene |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | SsADS | 催化 | 来自Streptomyces subrutilus，催化FPP生成(-)-amorpha-4,11-diene |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜/单萜） | — | NbEIZS | 催化 | 来自Nocardia brevicaena，催化FPP生成epi-isozizane，并具有GPP单萜合酶侧活性 |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | SfES | 催化 | 来自Streptomyces flavidovirens，催化FPP生成7-epi-α-eudesmol，同时产生hedycaryol和germacrene A |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | SsHS | 催化 | 来自Streptomyces sclerotialis，催化FPP生成hedycaryol和germacrene A混合物 |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | ScHS | 催化 | 来自Streptomyces catenulae，催化FPP生成hedycaryol和germacrene A混合物 |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | SfHS | 催化 | 来自Streptomyces ficellus，催化FPP生成hedycaryol和germacrene A混合物 |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（倍半萜） | — | SmGAS | 催化 | 来自Streptomyces morookaense，催化FPP生成germacrene A为主 |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（二萜） | — | KkAS | 催化 | 来自Kutzneria kofuensis，催化GGPP生成allokutznerene |
| 大肠杆菌 (E. coli) | 萜类生物合成（二倍半萜） | — | SSS | 催化 | 来自Streptomyces sp. Tü 2975，催化GFPP生成sesterviolene |
关键发现
- 从4018个序列构建系统发育树，选择15个酶表征
- 其中12个具有催化活性。KkdCS催化FPP生成(+)-δ-cadinol，制备产量5.5 mg（产率14%），[α]D25=+95.9
- SjaCS产生(+)-α-cadinene，产量1.3 mg（产率3.5%），[α]D25=+60.0
- SIADS和SsADS均为(-)-amorpha-4,11-diene合酶，SIADS产量1 mg（产率2.6%），[α]D25=-9.4
- NbEIZS催化FPP生成epi-isozizane，同时以GPP为底物产生myrcene、sylvestrene、γ-terpinene、cis-sabinene hydrate、terpinolene、linalool、cis-p-ment-2-en-1-ol、terpinen-4-ol和α-terpineol等9种单萜
- SfES以7-epi-α-eudesmol为主产物，并副产hedycaryol和germacrene A
- SsHS、ScHS、SfHS产生hedycaryol/germacrene A混合物，SmGAS以germacrene A为主产物
- KkAS以GGPP为底物高效产生allokutznerene
- SSS以GFPP为底物产生sesterviolene。另有3个同源酶中1个无表达、2个无活性。
研究结论
系统发育驱动的功能筛选是发现新型萜烯合酶的有效策略，成功鉴定出多个具有新功能的酶，但无法仅凭系统发育预测底物链长。细菌(-)-amorpha-4,11-diene合酶可能用于青蒿素合成途径的重构；新酶数据有助于未来机器学习预测萜烯合酶功能。