Redesign and reconstruction of a steviol-biosynthetic pathway for enhanced production of steviol in Escherichia coli
- 作者
- Jun Ho Moon, Kunjoong Lee, Jun Ho Lee, Pyung Cheon Lee
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-1291-x
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
异源微生物中甜菊醇（steviol）产量较低，需要代谢优化甜菊醇生物合成途径，以提高甜菊醇的产量。
研究策略
基于合成生物学方法对甜菊醇生物合成途径进行重新设计和重建，包括：5'UTR工程优化关键基因表达、N端修饰改善植物P450酶在E. coli中的功能性表达、采用融合蛋白策略提高P450与CPR的电子传递效率、通过基因组工程（CRISPR/Cas9）整合途径基因以建立无质粒系统，并通过删除gdhA基因提高NADPH/NADP+比例来增强氧化还原力供给。
核心内容
该研究通过重新设计与重建甜菊醇生物合成途径，在大肠杆菌中实现了甜菊醇的高效生产。研究者采用多层次的代谢工程策略：首先对关键基因进行5'UTR工程优化以提升翻译效率，其次对植物来源的细胞色素P450酶AtKO和CYP714A2进行N端修饰（trAtKO、trCYP714A2）以改善其在原核宿主中的膜结合表达，并构建了不同linker长度的融合蛋白UtrCYP714A2-AtCPR2来增强P450与其还原酶之间的电子传递。之后利用CRISPR/Cas9将途径基因整合到染色体上建立无质粒系统，并通过删除gdhA基因将NADPH/NADP+比率提高10%，进一步增强氧化还原力供给。摇瓶实验中，表达融合蛋白Fusion15的菌株产生19.1 mg/L甜菊醇，超过此前报道的15.47 mg/L；在批式生物反应器中，最优菌株MGIUKN/UtrAtKO_Fusion15_AtCPR2的甜菊醇产量达到38.4 mg/L，是对照菌株的4.3倍。该工作证明了组合运用表达工程和基因组工程策略可有效促进复杂萜类化合物在微生物中的过量合成，也为甜菊糖苷等其他高附加值萜类的途径优化提供了通用方法。
创新点
1. 对GGPPS、CDPS、KS、KO、CYP714A2等多个基因进行5'UTR工程优化；2. 对AtKO和CYP714A2进行N端修饰（trAtKO、trCYP714A2）以改善膜蛋白表达；3. 构建融合蛋白UtrCYP714A2-AtCPR2（不同linker长度），其中Fusion15[(GGGGS)3]显著提高甜菊醇产量；4. 采用CRISPR/Cas9基因组工程将途径基因整合到染色体，实现无质粒表达；5. 通过删除gdhA提高NADPH/NADP+比率，增强P450酶催化效率。
研究对象（13）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | MEP途径（甲基赤藓醇磷酸途径） | dxs | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶 | 催化 | 来源于Bacillus subtilis，整合于基因组以增强前体供给 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | MEP途径 | dxr | 1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶 | 催化 | 来源于E. coli，整合于基因组 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | MEP途径 | idi | 异戊烯基二磷酸异构酶 | 催化 | 来源于Enterococcus sp.，整合于基因组 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | MEP途径/萜类前体合成 | ispA | 法尼基二磷酸合酶 | 催化 | 来源于Enterococcus sp.，整合于基因组 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 甜菊醇生物合成（二萜前体） | GGPPS | 香叶基香叶基二磷酸合酶 | 催化 | 经过5'UTR工程（UTR_GGPPS），可从质粒或基因组表达 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 甜菊醇生物合成 | CDPS | ent-柯巴基二磷酸合酶 | 催化 | 经过5'UTR工程（UTR_CDPS），基因组整合表达 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 甜菊醇生物合成 | KS | ent-贝壳杉烯合酶 | 催化 | 经过5'UTR工程（UTR_KS），基因组整合表达 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 甜菊醇生物合成 | AtKO | ent-贝壳杉烯氧化酶（细胞色素P450） | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，N端修饰为trAtKO并5'UTR工程化（UtrAtKO）；天然AtKO在E. coli中不表达 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 甜菊醇生物合成 | SrKO | ent-贝壳杉烯氧化酶（细胞色素P450） | 催化 | 来自Stevia rebaudiana，N端修饰为trSrKO；与AtKO相比产量较低 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 甜菊醇生物合成 | CYP714A2 | 贝壳杉烯酸13-羟化酶（细胞色素P450） | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，N端修饰为trCYP714A2并5'UTR工程化（UtrCYP714A2）；与AtCPR2融合构建Fusion5/10/15 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 甜菊醇生物合成 | AtCPR2 | NADPH-细胞色素P450还原酶 | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，为P450酶提供电子；N端截短为trAtCPR2用于融合蛋白 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 甜菊醇生物合成 | — | 融合蛋白Fusion15 (UtrCYP714A2-(GGGGS)3-trAtCPR2) | 催化 | 通过柔性linker(GGGGS)3融合CYP714A2和CPR，提升电子传递效率，使甜菊醇产量最高 |
| Escherichia coli MG1655（衍生菌株MGI、MGIG、MGIUK、MGIUKN等） | 中心碳代谢/氧化还原平衡 | gdhA | 谷氨酸脱氢酶 | 调控 | 通过CRISPR/Cas9敲除gdhA，提高NADPH/NADP+比率（提高10%），增强P450酶催化效率 |
关键发现
- 在摇瓶培养中，基因组工程菌株MGIUK（5'UTR工程化GGPPS、CDPS、KS）产生205±35 mg/L ent-kaurene，而质粒系统为191±7 mg/L；批式生物反应器中，MGIUK菌株ent-kaurene产量达623.6±3.0 mg/L，比质粒系统（531.5±7.1 mg/L）高11%。N端修饰的AtKO（trAtKO）比天然SrKO产生更多ent-kaurenoic acid（31.8±1.7 vs
- 9±1.7 mg/L），5'UTR工程化trAtKO（UtrAtKO）进一步提高到41.4±5 mg/L。删除gdhA后NADPH/NADP+比率提高10%（0.51±0.04 vs
- 44±0.01），ent-kaurenoic acid产量达到50.7±9.8 mg/L（提高22.5%）。表达融合蛋白Fusion15[(GGGGS)3]的菌株在摇瓶中产生19.1±4.6 mg/L甜菊醇，高于此前报道的15.47 mg/L；在批式生物反应器中，MGIUKN/UtrAtKO_Fusion15_AtCPR2产生38.4±1.7 mg/L甜菊醇，是对照（8.8±0.3 mg/L）的4.3倍。
研究结论
通过5'UTR工程、融合蛋白策略、基因组工程以及氧化还原平衡调控，成功在E. coli中实现了甜菊醇的过量生产，最高产量达38.4 mg/L。这些表达工程和基因组工程策略可为微生物生产萜类化合物（包括甜菊糖苷和类胡萝卜素）提供通用方法，也表明代谢工程与合成生物学可直接应用于高附加值甜菊糖苷的途径优化。