Investigation of Bar-seq as a method to study population dynamics of Saccharomyces cerevisiae deletion library during bioreactor cultivation
- 作者
- Maren Wehrs, Mitchell G. Thompson, Deepanwita Banerjee, Jan-Philip Prahl, Norma M. Morella, Carolina A. Barcelos, Jadie Moon, Zak Costello, Jay D. Keasling, Patrick M. Shih, Deepti Tanjore, Aindrila Mukhopadhyay
- 单位
- Lawrence Berkeley National Laboratory; Joint BioEnergy Institute, Lawrence Berkeley National Laboratory; Advanced Biofuels and Bioproducts Process Development Unit, Lawrence Berkeley National Laboratory; Fred Hutchinson Cancer Research Center; Department of Energy Agile BioFoundry; University of California, Berkeley; University of California-Davis; Technical University of Denmark; Shenzhen Institutes for Advanced Technologies
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-01423-z
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
评估Bar-seq方法用于研究酿酒酵母缺失文库在工业生物反应器培养过程中群体动态的可行性，并理解工业发酵条件下菌株生理变化及群体适应性的遗传基础。
研究策略
使用带有条形码的原养型酿酒酵母缺失文库，通过两阶段种子培养后在不同培养环境（摇瓶、批次生物反应器、补料分批生物反应器）中进行竞争实验，结合Bar-seq测序分析突变体丰度变化、群体多样性和beta多样性，并通过基因本体富集分析鉴定关键基因。
核心内容
本研究利用带有条形码的原养型酿酒酵母缺失文库，系统评估了Bar-seq方法在工业生物反应器培养中追踪群体动态的可行性。作者将6002个条形码突变体经两阶段种子培养后，分别置于摇瓶、批次反应器和补料分批反应器中开展竞争实验，并比较了恒速补料与DO信号脉冲补料两种策略及不同pH条件的影响。结果显示，种子培养阶段群体高度一致（Pearson r>0.99），但所有反应器环境中仅8.6%的突变体被保留，其中0.53%在所有条件下完全丢失。恒速补料导致乙醇积累约37 g/L，引发剧烈的选择压力，使CF6条件下初始突变条形码最终丢失约65%，多样性降至初始的约35%；而DO信号补料下乙醇低于1 g/L，突变体丢失不足7.5%。时间因素解释了约36%的beta多样性方差。在补料批次中常见丢失的77个突变体中，28个与线粒体功能相关；保留的突变体富集盐胁迫响应基因，包括MSN4及多个GSK-3同源物（MCK1、RIM11、MRK1、YGK3），CF4条件还富集自噬相关基因（如ATG2、ATG8），而DF4则富集TCA循环和氧化应激基因。该研究证明Bar-seq能有效识别工业规模放大过程中的关键选择压力阶段和适应性遗传位点，为解析工业发酵条件下菌株适应性的遗传基础提供了有力工具。
创新点
首次将Bar-seq技术应用于模拟工业发酵条件的规模放大过程，系统比较了不同补料策略（恒速补料与DO信号脉冲补料）和pH对酵母缺失突变体群体结构和多样性的影响，揭示了补料策略导致的乙醇积累对群体选择压力的关键作用，并鉴定出与工业适应性相关的基因（如GSK-3同源物和自噬相关基因）。
研究对象（20）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 应激反应（一般应激反应） | MSN4 | Msn4p | 调控 | 应激响应转录激活因子，与Msn2p形成复合物结合STRE元件；其缺失突变体在多数条件下被保留 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 应激反应（GSK-3信号） | MCK1 | Mck1p | 调控 | 哺乳动物糖原合成酶激酶3（GSK-3）同源物，参与Msn2p依赖的应激基因转录；其缺失突变体在多种培养条件下均被富集 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 应激反应（GSK-3信号） | RIM11 | Rim11p | 调控 | GSK-3同源物，与应激响应相关 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 应激反应（GSK-3信号） | MRK1 | Mrk1p | 调控 | GSK-3同源物，与应激响应相关 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 应激反应（GSK-3信号） | YGK3 | Ygk3p | 调控 | GSK-3同源物，与应激响应相关 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 自噬（Cvt通路） | ATG2 | Atg2p | 区室化 | 在CF4中48-72h被选压的突变体，属于自噬相关基因 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 自噬（Cvt通路） | ATG3 | Atg3p | 区室化 | 在CF4中48-72h被选压的突变体 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 自噬（Cvt通路） | ATG4 | Atg4p | 区室化 | 在CF4中48-72h被选压的突变体 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 自噬（Cvt通路） | ATG8 | Atg8p | 区室化 | 在CF4中48-72h被选压的突变体 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 自噬（Cvt通路） | ATG9 | Atg9p | 区室化 | 在CF4中48-72h被选压的突变体 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 自噬（Cvt通路） | ATG31 | Atg31p | 区室化 | 在CF4中48-72h被选压的突变体 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 自噬（Cvt通路） | VPS30 | Vps30p | 区室化 | 在CF4中48-72h被选压的突变体 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | TCA循环 | CIT3 | Cit3p | 催化 | 在DF4中48-72h被选压的突变体，柠檬酸合酶 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | TCA循环 | IDH1 | Idh1p | 催化 | 在DF4中48-72h被选压的突变体，异柠檬酸脱氢酶 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 线粒体呼吸链 | COX8 | Cox8p | 能量供给 | 在DF4中48-72h被选压的突变体，细胞色素c氧化酶亚基 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 线粒体组织/呼吸 | TIM18 | Tim18p | 转运 | 在DF4中48-72h被选压的突变体，线粒体内膜转位酶亚基 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 氧化应激 | CTA1 | Cta1p | 催化 | 在DF4中48-72h被选压的突变体，过氧化氢酶A |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 氧化应激 | GPD1 | Gpd1p | 催化 | 在DF4中48-72h被选压的突变体，甘油-3-磷酸脱氢酶 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 核糖体生物合成 | RPS0A | Rps0Ap | 调控 | 在所有条件下均被低选的突变体，核糖体小亚基蛋白 |
| Saccharomyces cerevisiae BY4742 | 核糖体生物合成 | RPL8B | Rpl8Bp | 调控 | 在所有条件下均被低选的突变体，核糖体大亚基蛋白 |
关键发现
- 在6002个条形码基因中，2949个以至少10个计数被检测到。种子培养阶段群体高度相似（Pearson r>0.99）。在所有生物反应器环境中只有8.6%（212个条形码）突变体被保留，0.53%（13个）在所有条件下丢失。恒速补料（CF4和CF6）导致乙醇积累约37 g/L，而DO信号补料下乙醇<1 g/L。CF6在48-72h EFT期间丢失约23%的初始突变条形码，随后再丢失55%，最终多样性降至初始的约35%
- DF6在整个培养中丢失少于200个突变体（<7.5%）。CF4和DF4在48-72h丢失额外10%的突变体。PERMANOVA显示时间解释约36%的beta多样性方差（p<0.001），补料策略解释约7%（p=0.327）。在补料批次中常见丢失的77个突变体中，28个与线粒体相关（其中20个与线粒体包膜相关，9个与线粒体组织相关）。保留的突变体富集盐胁迫响应基因，包括MSN4和GSK-3同源物MCK1、RIM11、MRK1、YGK3。CF4中选压富集自噬和细胞应激相关基因（如ATG2、ATG3、ATG4、ATG8、ATG9、ATG31、VPS30），DF4中富集TCA循环和氧化应激相关基因（如CIT3、IDH1、COX8、TIM18、UPS3、AIM25、DIC1、GPH1、GPD1、MXR1、YBP1、CTA1）。
研究结论
Bar-seq可有效评估工业条件下酵母群体所面临的发酵相关胁迫，识别规模放大过程中出现变异和选择压力施加的关键阶段，为工业条件下菌株适应性的遗传位点和生物学应激反应研究提供了新途径。