Manipulating the position of DNA expression cassettes using location tags fused to dCas9 (Cas9-Lag) to improve metabolic pathway efficiency
- 作者
- Qianwen Xie, Siwei Li, Dongdong Zhao, Lijun Ye, Qingyan Li, Xueli Zhang, Li Zhu, Changhao Bi
- 单位
- 天津科技大学生物工程学院，天津300457，中国；病原微生物与生物安全国家重点实验室，北京生物工程研究所，北京100071，中国；中国科学院天津工业生物技术研究所，天津300308，中国；中国科学院系统微生物生物技术重点实验室，天津300308，中国
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-01496-w
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何通过操控目标DNA表达盒在细胞内的位置，提高代谢途径中膜结合酶的催化效率，从而改善类胡萝卜素等疏水产物的合成效率。
研究策略
将大肠杆菌膜锚定标签GlpF与去活Cas9（dCas9）融合形成Cas9-Lag分子装置，利用gRNA将目标DNA表达盒（质粒或染色体）牵引至细胞膜附近，使膜结合酶靠近底物并提高其功能表达。
核心内容
本研究构建了一种名为Cas9-Lag的分子装置，将大肠杆菌膜锚定标签GlpF与去活Cas9（dCas9）融合，借助引导RNA将目标DNA表达盒（质粒或染色体）牵引至细胞膜附近，使膜结合酶靠近底物并提升其功能表达，从而改善类胡萝卜素等疏水产物的合成。在荧光报告实验中，Cas9-Lag定位使RFP荧光强度降至对照的38.37%，证实表达盒被有效锚定至膜区域。将该策略应用于大肠杆菌CAR025菌株的类胡萝卜素合成途径：定位crtW表达盒后，canthaxanthin产量达2.93 mg/L，较对照提高14.0%；定位crtZ表达盒后，zeaxanthin产量达4.51 mg/L，提高18.8%；定位crtZW双基因表达盒后，astaxanthin产量达0.41 mg/L，提高24.2%。RT-PCR还显示，Cas9-Lag结合染色体idhA位点后，目标基因转录水平显著下调。结果表明，通过操纵DNA表达盒的细胞空间位置，可有效增强膜结合酶催化效率，为代谢工程提供了一种不依赖传统酶改造的空间优化新策略。
创新点
['首次开发了利用定位标签融合dCas9（Cas9-Lag）来操纵DNA表达盒细胞定位的分子装置', '通过Cas9-Lag在E. coli中构建类胡萝卜素合成的‘准细胞器’，显著提高玉米黄质和虾青素产量']
研究对象（8）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli ATCC 8739 | 类胡萝卜素合成 | — | GlpF-dCas9 | 区室化 | Cas9-Lag分子装置，由膜定位标签GlpF和dCas9融合而成，通过gRNA将目标DNA拉到细胞膜 |
| Escherichia coli ATCC 8739 | 类胡萝卜素合成 | crtZ | CrtZ | 催化 | 来自Pantoea agglomerans的β-胡萝卜素3,3'-羟化酶，催化β-胡萝卜素转化为玉米黄质，有两个跨膜区 |
| Escherichia coli ATCC 8739 | 类胡萝卜素合成 | crtW | CrtW | 催化 | 来自Brevundimonas sp. SD212的β-胡萝卜素4,4'-氧合酶，催化β-胡萝卜素转化为角黄素/虾青素，有四个跨膜区 |
| Escherichia coli CAR025 | 类胡萝卜素合成 | crtZ | CrtZ | 催化 | 定位crtZ表达质粒后，玉米黄质产量提高29.0% |
| Escherichia coli CAR025 | 类胡萝卜素合成 | crtW | CrtW | 催化 | 定位crtW表达质粒后，角黄素产量提高17.4% |
| Escherichia coli CAR025 | 类胡萝卜素合成 | crtW;crtZ | CrtW/CrtZ | 催化 | 定位双基因表达盒后，虾青素产量提高26.7% |
| Escherichia coli CAR005/CAR015 | — | idhA | — | 调控 | 染色体上idhA作为靶点，用于电镜观察基因组被拉向膜，转录水平显著下降（CAR005为14.10%，CAR015为8.58%） |
| Escherichia coli ATCC 8739 | 类胡萝卜素合成 | crtE, crtB, crtI, crtY | CrtE, CrtB, CrtI, CrtY | 催化 | 类胡萝卜素合成途径上游酶，负责合成β-胡萝卜素 |
关键发现
- RFP荧光强度降至对照的38.37%
- 在CAR025菌株中，利用Cas9-Lag定位crtW表达盒，canthaxanthin产量达到2.93 mg/L，比对照提高14.0%，单位产量0.54 mg/g DCW提高17.4%
- 定位crtZ表达盒后，zeaxanthin产量达4.51 mg/L，提高18.8%，单位产量0.89 mg/g DCW提高29.0%
- 定位crtZW双基因表达盒后，astaxanthin产量达0.41 mg/L，提高24.2%，单位产量0.19 mg/g DCW提高26.7%。RT-PCR显示，Cas9-Lag结合染色体idhA位点后，CAR005和CAR015中idhA转录水平分别降至亲本菌株的14.10%和8.58%。
研究结论
本研究成功构建了Cas9-Lag分子装置，通过将DNA表达盒定位到细胞膜附近，增强了膜结合酶的功能表达，有效提高了玉米黄质和虾青素的产量，为代谢工程提供了一种新的空间优化策略。