A modular pathway engineering strategy for the high-level production of \(\beta\) -ionone in Yarrowia lipolytica
- 作者
- Yanping Lu, Qingyu Yang, Zhanglin Lin, Xiaofeng Yang
- 单位
- School of Biology and Biological Engineering, South China University of Technology; Guangdong Provincial Key Laboratory of Fermentation and Enzyme Engineering, South China University of Technology
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-01309-0
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
在解脂耶氏酵母中实现β-紫罗兰酮的高水平生物合成，解决天然产物代谢途径长、调控复杂导致产量低的问题。
研究策略
采用模块化途径工程策略，将β-紫罗兰酮生物合成途径分为乙酰辅酶A供给模块、MVA模块和β-紫罗兰酮合成模块，共七个单元，通过CRISPR-Cas9介导的基因组整合逐步组装并优化，结合发酵条件优化。
核心内容
该研究采用模块化途径工程策略，在解脂耶氏酵母中实现β-紫罗兰酮的高水平生物合成。研究者将合成途径划分为乙酰辅酶A供给、MVA和β-紫罗兰酮合成三个模块共七个单元，利用CRISPR-Cas9介导的基因组整合逐步组装并优化各模块。基线菌株产量仅为3.5 mg/L，过表达tHMG1和GGS1后产量提升15倍至54.2 mg/L；整合全部MVA模块九个基因后产量达152.9 mg/L。进一步在xpr2位点引入PK-PTA途径增强胞质乙酰辅酶A供应，产量提高32%至202.2 mg/L；随后通过氮源替换（以色氨酸替代蛋白胨）使摇瓶产量达358.4 mg/L。最终在3-L生物反应器中，将溶氧水平控制在15%并采用17天补料分批发酵，获得0.98 g/L β-紫罗兰酮，为当时微生物细胞工厂报道的最高产量。研究还发现溶氧是该生物合成过程的关键参数，过低（0-5%）或过高（25-35%）均显著降低产量。该模块化策略为其他萜类化合物在解脂耶氏酵母中的高效合成提供了可借鉴的通用方案。
创新点
['首次在解脂耶氏酵母中引入PK-PTA途径以增加胞质乙酰辅酶A供应，用于萜类生产', '将整个途径划分为三个模块七个单元，实现快速组装和逐步评估', '发现溶氧水平是β-紫罗兰酮生物合成的关键参数，优化后产量显著提升', '获得的β-紫罗兰酮产量（0.98 g/L）为当时微生物细胞工厂报道的最高水平']
研究对象（18）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Yarrowia lipolytica | β-紫罗兰酮合成途径 | carB | phytoene dehydrogenase | 催化 | 来自Mucor circinelloides，Module 3 |
| Yarrowia lipolytica | β-紫罗兰酮合成途径 | carRP | phytoene synthase/lycopene cyclase | 催化 | 来自Mucor circinelloides，Module 3 |
| Yarrowia lipolytica | β-紫罗兰酮合成途径 | CCD1 | carotenoid cleavage dioxygenase 1 | 催化 | 来自Petunia hybrida，催化β-胡萝卜素裂解为β-紫罗兰酮 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | tHMG1 | truncated 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase | 催化 | 截短型HMG-CoA还原酶，去除N端500个氨基酸，增强胞质稳定性 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | GGS1 | geranylgeranyl diphosphate synthase | 催化 | Module 2中催化GGPP合成 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | ERG10 | acetoacetyl-CoA thiolase | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | ERG13 | hydroxymethylglutaryl-CoA synthase | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | ERG8 | phosphomevalonate kinase | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | ERG12 | mevalonate kinase | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | ERG19 | mevalonate diphosphate decarboxylase | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | IDI | isopentenyl diphosphate isomerase | 催化 | 内源基因 |
| Yarrowia lipolytica | MVA途径 | ERG20 | geranyl/farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 内源基因，FPP合酶 |
| Yarrowia lipolytica | 乙酰辅酶A供给途径（PK-PTA） | bbPK | phosphoketolase | 催化 | 来自Bifidobacterium bifidum |
| Yarrowia lipolytica | 乙酰辅酶A供给途径（PK-PTA） | bsPTA | phosphotransacetylase | 催化 | 来自Bacillus subtilis |
| Yarrowia lipolytica | 乙酰辅酶A供给途径（PK-PTA） | lmPK | phosphoketolase | 催化 | 来自Leuconostoc mesenteroides，用于筛选 |
| Yarrowia lipolytica | 乙酰辅酶A供给途径（PK-PTA） | ckPTA | phosphotransacetylase | 催化 | 来自Clostridium kluyveri，用于筛选 |
| Yarrowia lipolytica | 同源重组修复途径 | ku70 | Ku70 | 调控 | 敲除以提高同源重组效率 |
| Yarrowia lipolytica | 同源重组修复途径 | ku80 | Ku80 | 调控 | 敲除以提高同源重组效率 |
关键发现
- ['基线菌株YLBI0004仅产生3.5±0.2 mg/L β-紫罗兰酮', '过表达tHMG1和GGS1的YLBI3001产量为54.2±4.0 mg/L（4.3±0.2 mg/g DCW），比基线提高15倍', '整合全部MVA模块九个基因后，YLBI3017产量达152.9±5.8 mg/L（9.8±0.5 mg/g DCW），比基线提高43.7倍', '引入PK-PTA（bbPK-bsPTA）至xpr2位点后，YLBI3117产量为202.2±13.6 mg/L（15.4±0.4 mg/g DCW），比YLBI3017提高32%', '增加一个拷贝的Module 3后，YLBI3118产量为220.7±8.0 mg/L（18.1±0.9 mg/g DCW），仅提高9%', '补充亮氨酸后YLBI3119生物量增加89%，但单位细胞产量从19.2±2.5降至10.8±0.5 mg/g DCW', '用色氨酸替代蛋白胨作为氮源后，摇瓶产量提高到358.4±25.0 mg/L（19.2±2.5 mg/g DCW）', '在3-L生物反应器中，当溶氧（DO）设置为15%时，经17天补料分批发酵获得0.98 g/L β-紫罗兰酮，为当时最高产量', 'DO为0-5%时产量仅322 mg/L
- DO为25%和35%时产量分别为0.55 g/L和0.40 g/L', 'PK-PTA途径的引入使乙酸积累从0.45 g/L增加到0.99 g/L（bbPK-bsPTA）']
研究结论
通过模块化途径工程结合发酵优化，在GRAS菌株解脂耶氏酵母中实现了β-紫罗兰酮的高水平生产，获得当时微生物细胞工厂报道的最高产量（0.98 g/L），证明该策略可适用于其他萜类化合物的高效生物合成。