Metabolic engineering Saccharomyces cerevisiae for de novo production of the sesquiterpenoid (+)-nootkatone
- 作者
- Xiangfeng Meng, Hui Liu, Wenqiang Xu, Weixin Zhang, Zheng Wang, Weifeng Liu
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2020）
- DOI
- 10.1186/s12934-020-1295-6
- 所属领域
- 代谢工程/合成生物学
- 关键词
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解决的核心问题
在酿酒酵母中实现(+)-nootkatone的从头生物合成，克服(+)-valencene前体供应不足和(+)-valencene选择性氧化为(+)-nootkatone效率低的问题。
研究策略
在酿酒酵母中过表达(+)-valencene合酶CnVS，结合MVA途径工程（ERG20/CnVS融合表达、tHMG1过表达、ERG9启动子替换为P_HXT1动态下调）提高(+)-valencene产量；再通过共表达HPO P450酶和筛选SDR脱氢酶（ZSD1、ABA2）催化β-nootkatol氧化为(+)-nootkatone。
核心内容
该研究在酿酒酵母W303-1A中实现了倍半萜(+)-nootkatone的从头生物合成。为克服前体(+)-valencene供应不足与氧化效率低的问题，作者过表达(+)-valencene合酶CnVS，并通过融合表达ERG20/CnVS、过表达截短HMG-CoA还原酶tHMG1以及用P_HXT1动态下调ERG9等多维度工程改造MVA途径。单独表达CnVS仅产(+)-valencene 11.6 mg/L，经组合工程后最高产量达217.95 mg/L，较初始菌株提升约19倍。随后共表达prennaspirodiene oxygenase（HPO）与细胞色素P450还原酶ATR1，使(+)-nootkatone产量达9.66 mg/L，但主要积累中间产物β-nootkatol。进一步筛选并鉴定出两种高效植物短链脱氢酶ZSD1和ABA2，可催化β-nootkatol氧化为(+)-nootkatone；额外过表达ZSD1使产量提升至59.78 mg/L，ABA2为53.48 mg/L。添加1% DMSO可进一步提高产量。该研究首次在酵母中实现(+)-nootkatone的从头合成，达到59.78 mg/L，为规模化生产该高价值香料提供了可行菌株基础。
创新点
首次在酿酒酵母中实现从头合成(+)-nootkatone达到59.78 mg/L；鉴定出两种高效植物SDR脱氢酶ZSD1和ABA2可催化β-nootkatol转化为(+)-nootkatone；通过组合MVA工程策略使(+)-valencene产量达217.95 mg/L。
研究对象（11）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | MVA pathway | tHMG1 | truncated HMG-CoA reductase | 催化 | 限速酶，过表达增加前体供应 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | MVA pathway | ERG20 | farnesyl diphosphate synthase | 催化 | 与CnVS融合表达提高通量 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | Sesquiterpene biosynthesis | CnVS | (+)-valencene synthase | 催化 | 来自Callitropsis nootkatensis |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | Ergosterol biosynthesis | ERG9 | squalene synthase | 催化 | 通过替换启动子为P_HXT1动态下调以减少竞争 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | (+)-nootkatone biosynthesis | HPO | prennaspirodiene oxygenase (CYP71D55) | 催化 | 突变体V482I/A484I，氧化(+)-valencene |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | (+)-nootkatone biosynthesis | ATR1 | cytochrome P450 reductase | 催化 | 来自Arabidopsis thaliana，为HPO提供电子 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | (+)-nootkatone biosynthesis | ZSD1 | short-chain dehydrogenase/reductase | 催化 | 来自Zingiber zerumbet，高效催化β-nootkatol氧化 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | (+)-nootkatone biosynthesis | ABA2 | short-chain dehydrogenase/reductase | 催化 | 来自Citrus sinensis，催化β-nootkatol氧化 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | (+)-nootkatone biosynthesis | ADH-C3 | alcohol dehydrogenase | 催化 | 来自Pichia pastoris，对照有效 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | (+)-nootkatone biosynthesis | ADH2/ADH6 | alcohol dehydrogenase | 催化 | 来自Saccharomyces cerevisiae，无显著效果 |
| Saccharomyces cerevisiae W303-1A | (+)-nootkatone biosynthesis | ValOx | lipoxygenase | 催化 | 来自Pleurotus sapidus，未检测到活性 |
关键发现
- 单独表达CnVS产生(+)-valencene
- 6 mg/L；结合MVA工程（tHMG1、ERG20融合、ERG9下调）最高产(+)-valencene
- 95 mg/L（V15，比V02提高19倍）；过表达HPO V482I/A484I和ATR1后，(+)-nootkatone产量9.66 mg/L，主要产物为β-nootkatol；额外过表达ZSD1使(+)-nootkatone产量提高到59.78 mg/L，过表达ABA2为53.48 mg/L，过表达ADH-C3为49.01 mg/L；添加1% DMSO可提高(+)-nootkatone产量；10% n-dodecane对酵母生长影响微小。
研究结论
通过过表达CnVS、HPO和SDR脱氢酶并工程化MVA途径，成功在酿酒酵母中构建(+)-nootkatone生物合成途径，产量达到59.78 mg/L，为工业化生产提供了基础。