Improving astaxanthin production in Escherichia coli by co-utilizing CrtZ enzymes with different substrate preference
- 作者
- Meng Zhang, Zhongkuo Gong, Jinlei Tang, Fuping Lu, QingYan Li, XueLi Zhang
- 单位
- College of Biotechnology, Tianjin University of Sciences and Technology, Tianjin 300457, China; Tianjin Institute of Industrial Biotechnology, Chinese of Academy of Sciences, 32 Xiqidao, Tianjin Airport Economic Park, Tianjin 300308, China; Key Laboratory of Systems Microbial Biotechnology, Chinese Academy of Sciences, Tianjin 300308, China; National Technology Innovation Center of Synthetic Biology, Tianjin 300308, China; University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100071, China
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2022）
- DOI
- 10.1186/s12934-022-01798-1
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
β-胡萝卜素羟化酶（CrtZ）的不同底物偏好影响虾青素合成产量及中间产物积累，需解决如何组合利用不同来源的CrtZ以提高虾青素产量并减少副产物的问题。
研究策略
构建高产β-胡萝卜素和角黄素的平台菌株，分别表达来自Paracoccus sp. PC1的PCCrtZ和来自Pantoea agglomerans的PACrtZ，验证其底物偏好；随后在产虾青素菌株中组合表达两种CrtZ，通过染色体整合多拷贝基因及补料分批发酵优化产量。
核心内容
该研究针对β-胡萝卜素羟化酶（CrtZ）底物偏好差异限制大肠杆菌虾青素合成的问题，提出组合利用不同来源CrtZ同工酶的策略。作者先在平台菌株中分别表达Paracoccus sp. PC1来源的PCCrtZ和Pantoea agglomerans来源的PACrtZ，证实前者偏好角黄素、后者偏好β-胡萝卜素，且PACrtZ合成玉米黄素的能力显著更强（摇瓶最高36.74 mg/L vs 2.7 mg/L）。随后在产虾青素菌株中组合表达两种酶，发现2拷贝PCCrtZ的Ast017产量达19.84 mg/L；增加至3拷贝后Ast018升至21.1 mg/L，但4拷贝时产量下降34%。同时，2拷贝PACrtZ与1拷贝PCCrtZ组合的Ast010摇瓶产24.5 mg/L，比Ast018高16%。补料分批发酵中，Ast018在70小时产1.73 g/L虾青素（12 mg/g DCW），较Ast017提高57%，副产物角黄素和adonirubin分别降低50%和31%；Ast010在67小时最高产1.82 g/L，占总类胡萝卜素的65%，为迄今工程大肠杆菌报道的最高水平。结果表明，按底物偏好合理搭配CrtZ同工酶可有效平衡合成通量、减少副产物积累，为类胡萝卜素途径酶适配提供了新思路。
创新点
首次在大肠杆菌中利用具有不同底物偏好（β-胡萝卜素偏好与角黄素偏好）的CrtZ同工酶进行组合表达，显著提高虾青素产量及其在总类胡萝卜素中的比例。
研究对象（4）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Escherichia coli | 类胡萝卜素生物合成 | crtY | 番茄红素环化酶 | 催化 | 催化番茄红素转化为β-胡萝卜素，增加crtY拷贝用于减少番茄红素积累 |
| Escherichia coli | 虾青素生物合成 | crtW* | β-胡萝卜素酮化酶（突变体） | 催化 | 来源于Brevundimonas sp. SD212，催化β-胡萝卜素酮化生成角黄素等酮类胡萝卜素 |
| Escherichia coli | 虾青素生物合成 | PACrtZ | β-胡萝卜素羟化酶（来源于Pantoea agglomerans） | 催化 | 偏好β-胡萝卜素底物，主要催化生成玉米黄素 |
| Escherichia coli | 虾青素生物合成 | PCCrtZ | β-胡萝卜素羟化酶（来源于Paracoccus sp. PC1） | 催化 | 偏好角黄素底物，高效催化角黄素转化为虾青素 |
关键发现
- PCCrtZ偏好角黄素，PACrtZ偏好β-胡萝卜素。在摇瓶中，表达PACrtZ的Zea003和Zea004分别产生16.78和36.74 mg/L玉米黄素，而表达PCCrtZ的Zea001和Zea002仅产生1.23和2.7 mg/L。在角黄素平台Can004中，Ast017（2拷贝PCCrtZ）产虾青素19.84 mg/L，比Ast015（2拷贝PACrtZ）高21%。5-L发酵中，Ast017在60h产1.1 g/L虾青素（8 mg/g DCW），副产物角黄素1.1 g/L和adonirubin 0.42 g/L。增加PCCrtZ拷贝后，Ast018（3拷贝）摇瓶产21.1 mg/L，较Ast017高21%
- Ast019（4拷贝）产量下降34%至13.12 mg/L。Ast010（2拷贝PACrtZ+1拷贝PCCrtZ）摇瓶产24.5 mg/L，比Ast018高16%。补料分批发酵中，Ast018在70h产1.73 g/L虾青素（12 mg/g DCW），比Ast017高57%，副产物角黄素和adonirubin分别降低50%和31%
- Ast010在67h最高产1.82 g/L虾青素，占总类胡萝卜素的65%，为目前工程大肠杆菌中报道的最高产量。
研究结论
组合利用不同底物偏好的CrtZ同工酶可显著提高虾青素产量并增加其在总类胡萝卜素中的占比，获得迄今工程大肠杆菌中最高的虾青素产量。