Macular pigment-enriched oil production from genome-edited microalgae
- 作者
- Inhwa Song, Sunbin Kim, Jongrae Kim, Hyeonjun Oh, Junhwan Jang, Su Jin Jeong, Kwangryul Baek, Weon-Sun Shin, Sang Jun Sim, EonSeon Jin
- 单位
- Department of Life Science, Research Institute for Natural Sciences, Hanyang University, Seoul 04763, Republic of Korea; Department of Food and Nutrition, College of Human Ecology, Hanyang University, Seoul 04763, Republic of Korea; Department of Chemical and Biological Engineering, Korea University, Seoul, South Korea
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2022）
- DOI
- 10.1186/s12934-021-01736-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
如何在不引入抗生素抗性标记的前提下，通过代谢工程改造莱茵衣藻，使其同时高产油脂和类胡萝卜素（叶黄素、玉米黄质），并开发出安全、高效的培养与提取工艺，用于生产富含黄斑色素的可食用微藻油。
研究策略
在已有的玉米黄质环氧酶（ZEP）基因敲除突变体（zep）基础上，利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白（RNP）介导的DNA-free基因编辑技术，进一步敲除ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGP）基因，构建双基因敲除突变体（dZAs），阻断淀粉合成以增强脂质积累，同时保留玉米黄质的高产特性；优化培养基（1/4NP2A）实现一步法油脂诱导培养；采用正己烷/异丙醇（3:2）混合溶剂开发食品级油脂提取方法。
核心内容
本研究在莱茵衣藻中利用CRISPR-Cas9核糖核蛋白介导的DNA-free基因编辑技术，于玉米黄质环氧酶基因敲除突变体基础上进一步敲除ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，构建了双基因敲除突变体dZAs，旨在同时实现油脂与黄斑色素的高效积累且不引入抗生素抗性标记。通过优化1/4NP2A培养基实现一步法油脂诱导培养，并采用正己烷/异丙醇混合溶剂建立食品级提取工艺。结果显示，dZA1在氮缺乏条件下叶黄素含量达2.93 mg/g DCW，玉米黄质含量为3.12 mg/g DCW，总脂质为450.09 mg/g DCW，较野生型提升约一倍；dZA2总脂质进一步提升至505.6 mg/g DCW。一步法培养使油脂产率提高至144.51 mg/g/day，为两步法的1.8倍且培养时间缩短约33%。从1 g dZA1干重可获得196 mg可食用油，其中叶黄素和玉米黄质含量分别为8.42和7.69 mg/g油，约90%色素保留于油中，为微藻源功能性食用油的开发提供了安全高效的生产路径。
创新点
['采用DNA-free CRISPR-Cas9 RNP方法在zep突变体中进行第二次基因编辑，获得无抗生素标记的双基因敲除突变体dZA。', '开发一步法培养工艺（1/4NP2A培养基），省去传统两步法中更换培养基的步骤，培养时间缩短约33%，油脂产率提升约81%。', '建立食品级正己烷/异丙醇提取方法，得到富含叶黄素和玉米黄质的可食用微藻油，萃取过程不使用有毒溶剂。']
研究对象（3）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Chlamydomonas reinhardtii CC-4349 cw15 mt- | 类胡萝卜素/叶黄素循环 | ZEP | Zeaxanthin epoxidase | 催化 | 催化玉米黄质转化为紫黄质，敲除后导致玉米黄质积累。 |
| Chlamydomonas reinhardtii CC-4349 cw15 mt- | 淀粉生物合成 | AGP (Cre03.g188250.t1.2) | ADP-glucose pyrophosphorylase | 催化 | 催化ADP-葡萄糖合成，是淀粉合成的关键酶，敲除后淀粉合成受阻，碳流转向脂肪酸和油脂合成。 |
| Chlamydomonas reinhardtii CC-4349 cw15 mt- | 基因编辑工具 | Cas9 | Streptococcus pyogenes Cas9蛋白 | 催化 | 作为CRISPR-Cas9 RNP复合物组分，用于靶向敲除ZEP和AGP基因。 |
关键发现
- dZA1在氮缺乏条件下，叶黄素含量为2.93±0.22 mg/g DCW，玉米黄质含量为3.12±0.30 mg/g DCW，总脂质含量为450.09±25.48 mg/g DCW
- dZA2中分别为2.55 mg/g DCW、3.18 mg/g DCW和505.6 mg/g DCW。与zep亲株相比，dZAs的玉米黄质含量提高约35%，dZA1的叶黄素含量提高约20%
- 总脂质从野生型的221.3 mg/g DCW和zep的254.3 mg/g DCW分别提升至dZA1的450.0和dZA2的505.6 mg/g DCW。总脂肪酸甲酯（FAME）在dZA1和dZA2中分别为265和296 mg/g DCW，而野生型为98 mg/g DCW，zep为128 mg/g DCW。一步法培养时dZAs的油脂产率平均为144.51 mg/g/day，是两步法（79.64 mg/g/day）的1.8倍，而色素产率相当。优化提取后，从1 g dZA1干重可获得196±20.1 mg可食用油，其中叶黄素和玉米黄质含量分别为8.42±0.92 mg/g油和7.69±1.03 mg/g油
- 提取率为37.2%，约90%的色素保留在油中。
研究结论
通过CRISPR-Cas9介导的AGP基因敲除，在ze突变体基础上成功构建了双基因敲除突变体dZAs，该突变体在氮缺乏条件下同时高效积累油脂和黄斑色素。优化的一步法培养工艺和食品级提取方法实现了富含叶黄素和玉米黄质的可食用微藻油的生产，该产品有望应用于功能性食品和营养保健品，并有助于微藻的商业化利用。