Next-generation stress-inducible Komagataella phaffi promoter variants
- 作者
- Katharina Ebner, Núria Bernat-Camps, Simona Scheipel, Corina Dörner, Francisco Valero, Anton Glieder, Xavier Garcia-Ortega
- 单位
- Bisy GmbH, Wuenschendorf 292, Hofstaetten/Raab 8200, Austria; Department of Chemical, Biological and Environmental Engineering, Universitat Autonoma de Barcelona, Bellaterra (Cerdanyola del Valles) 08193, Spain; Austrian Centre of Industrial Biotechnology (ACIB), Graz, Austria; Institute of Molecular Biotechnology, Graz University of Technology, NAWI Graz, Petersgasse 14, Graz 8010, Austria
- 杂志
- Microbial Cell Factories（2025）
- DOI
- 10.1186/s12934-025-02825-7
- 所属领域
- 代谢工程
- 关键词
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解决的核心问题
K. phaffii现有常用强启动子多依赖甲醇诱导（如P_AOX1）或与生长偶联（如P_GAP），缺乏生长去偶联且甲醇非依赖的强启动子，限制了重组蛋白高效生产；同时，对生长去偶联的PDH启动子（HSP12基因上游352bp）的序列-功能关系缺乏了解，需要系统工程改造以提升其强度并解析调控机制。
研究策略
采用半理性block-scanning方法，分别用10bp V序列（5' GATAACCGTG 3'）和3bp A序列（5' AAA 3'）对PDH启动子进行系统替换突变，构建152个单点变体；通过eGFP高通量筛选鉴定有益突变和调控热点；将有益突变组合成多组合变体，并引入已知顺式元件（HSE、STRE、Phd1结合位点）构建第二代变体；用分泌型CalB和AbrUPO验证变体的应用潜力，并在摇瓶和补料分批反应器中评估最优变体MV2。
核心内容
本研究针对Komagataella phaffii缺乏甲醇非依赖且生长去偶联的强启动子这一瓶颈，以应激响应型PDH启动子（HSP12基因上游352 bp）为对象，采用半理性block-scanning策略，分别用10 bp V序列和3 bp A序列进行系统替换突变，构建了152个单点变体并经eGFP高通量筛选。通过组合有益突变并引入HSE、STRE等顺式元件，获得多组合变体allA、MV1和MV2，活性达亲本PDH的200–250%，较组成型P_GAP高2–6倍。在补料分批培养中，MV2-C菌株的CalB效价达48.4 kU，比亲本PDH-C高80%，约为P_GAP最佳条件的3倍；比生产速率达7.7 U/g/h，较PDH-C高1.7倍，产物/生物量得率比PDH-C和GAP-C分别高60%和约500%，总蛋白浓度0.460 g/L，较甲醇诱导的P_AOX1过程高20%。该工作解析了PDH启动子的序列-功能关系，鉴定了-252至-162调控热点和潜在转录因子结合位点，所获变体为K. phaffii无甲醇重组蛋白高效生产提供了有力工具。
创新点
['首次对甲醇非依赖且生长去偶联的K. phaffii PDH启动子进行系统性半理性扫描突变，解析了序列-功能关系。', '发现一个10bp合成序列（V序列）的插入可显著增强启动子活性，多组合变体活性最高达亲本PDH的250%。', '通过组合A库中的A79和A117等弱有益突变获得协同增强效应，获得最优变体MV2，在补料分批培养中性能超过亲本和P_GAP基准，接近甚至部分超过甲醇诱导的P_AOX1系统。']
研究对象（10）
| 底盘细胞 | 代谢通路 | 基因 | 蛋白 | 功能 | 说明 |
|---|---|---|---|---|---|
| Komagataella phaffii | 应激响应（碳源限制） | HSP12（上游352bp启动子区） | — | 调控 | PDH启动子为HSP12基因上游352bp区域，通过半理性block-scanning产生152个变体，多组合变体活性达亲本PDH的200-250% |
| Komagataella phaffii | 重组蛋白表达（报告系统） | eGFP | 增强型绿色荧光蛋白 | 催化 | 胞内报告蛋白，用于启动子变体活性高通量筛选，荧光与转录水平直接相关 |
| Komagataella phaffii | 重组蛋白分泌表达 | calB | CalB（Candida antarctica脂肪酶B） | 催化 | 工业脂肪酶，用于验证启动子变体；摇瓶中MV1-C和MV2-C产量比亲本PDH-C高60%和90% |
| Komagataella phaffii | 重组蛋白分泌表达 | abrUPO | AbrUPO（非特异性过氧合酶） | 催化 | 分泌型目标蛋白，摇瓶中allA-U和MV1-U酶活比亲本PDH-U分别提高约40-60%和60-80%，比P_GAP高4-7倍 |
| Komagataella phaffii | 中心碳代谢（糖酵解） | GAP（TDH3） | 甘油醛-3-磷酸脱氢酶 | 调控 | P_GAP组成型生长偶联启动子，作为无甲醇基准对照 |
| Komagataella phaffii | 甲醇利用（MUT）通路 | AOX1 | 醇氧化酶1 | 调控 | P_AOX1甲醇诱导强启动子，作为工业金标准对照，用于MV2-C的fed-batch性能比较 |
| Komagataella phaffii | 应激响应 | MSN2 | Msn2p（应激响应转录因子） | 调控 | 预测结合PDH启动子中的STRE位点（VGGGG），对应变体V11/12和V19活性下降 |
| Komagataella phaffii | 碳源调控/MUT通路 | MXR1 | Mxr1p（甲醇表达调控因子1） | 调控 | 预测结合PDH启动子-245至-239区域，可能参与碳源响应调控 |
| Komagataella phaffii | 热激响应 | HSF1 | Hsf1p（热激转录因子） | 调控 | 预测结合PDH中的HSE位点（GAA重复），相关变体V13-V17显示不同效果 |
| Komagataella phaffii | 铁离子稳态 | AFT1/AFT2 | Aft1/2p（铁响应转录因子） | 调控 | 预测为负调控因子，结合RCACCC motif，对应V18活性升高 |
关键发现
- 半理性block-scanning产生的152个PDH启动子变体，eGFP荧光水平为亲本启动子的10-150%
- 多组合变体allA、MV1和MV2活性为亲本PDH的200-225%，最高达250%，且比组成型P_GAP高2-6倍。在摇瓶培养中，MV1-C和MV2-C菌株的CalB脂肪酶活性比亲本PDH-C分别高60%和90%，总蛋白浓度达97±10和111±2 mg/L
- AbrUPO生产菌株allA-U和MV1-U比亲本分别提高约40-60%和60-80%，酶活比P_GAP高4-7倍。在补料分批培养（0.025 h^-1）中，MV2-C的CalB效价达48.4 kU，比PDH-C高80%，约为P_GAP最佳条件的3倍
- 比生产速率qp为7.7 U/g/h，比PDH-C和低μ下的GAP-C分别高1.7倍和3.1倍
- 产物/生物量得率Yp/X比PDH-C和GAP-C最佳条件分别高60%和约500%
- 总蛋白浓度0.460±0.071 g/L，比P_AOX1甲醇诱导过程的总蛋白高20%，按生产时长计算则高60%。
研究结论
通过系统性块扫描和组合工程，成功创建了一系列PDH启动子变体，不仅阐明了该启动子中关键正负调控区域（如-252至-162为调控热点、-162至-102为重要正调控区）和潜在转录因子结合位点（如STRE、HSE、Mxr1p位点），还获得了多组合变体MV1/MV2等，在无甲醇、生长去偶联条件下实现重组蛋白高效生产。其中MV2-C在补料分批中表现最佳，为K. phaffii多基因平衡表达和合成生物学应用提供了有价值的启动子工具。